轉錄因子AP-4在胃癌中的表達及其腫瘤生物學功能和機制的研究.pdf

1、第一部分轉錄因子AP-4在胃癌中的表達及臨床意義
　　 目的:檢測轉錄因子AP-4在胃癌中的表達，探索AP-4基因在胃癌中的作用，以及AP-4在胃癌中的表達與臨床病理資料之間的關系。
　　 方法:2005~2007年間，收取胃癌組織標本98例與癌旁正常胃粘膜組織66例，采用免疫組織化學染色方法和免疫蛋白印跡法檢測各組織中AP-4 蛋白的表達，實時定量聚合酶鏈反應檢測mRNA的表達。比較AP-4的表達與臨床病理特征及預后的

2、關系。
　　 結果:免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)AP-4在腫瘤組織的陽性表達率為83.67％，高于正常組織的40.91％，差異有統(tǒng)計學意義；而且，AP-4的表達與腫瘤浸潤深度，分化程度，淋巴結轉移及pTNM分期呈正相關；實時定量聚合酶鏈反應和免疫蛋白印跡檢測胃癌組織中AP-4的相對表達也明顯高于正常組織；生存分析發(fā)現(xiàn)，AP-4 陽性表達患者的中位生存期明顯短于陰性表達的患者。
　　 結論:轉錄因子AP-4在腫瘤組織中呈明顯高表達狀態(tài)

3、，其表達水平隨著T、N、M分期和pTNM分期的升高而升高；而且，AP-4的高表達提示預后不良。因此，AP-4基因可能作為癌基因參與胃癌的發(fā)生和發(fā)展。
　　 第二部分下調AP-4的表達對胃癌細胞增殖和化療藥物效果的影響
　　 目的：探討下調AP-4的表達對胃癌細胞體外增殖及其對化療藥物效果的影響。
　　 方法：以脂質體介導的AP-4特異性siRNAs轉染胃癌AGS細胞，實時定量聚合酶鏈反應及免疫蛋白印跡法檢測轉染后

4、不同時間點AP-4的表達情況，以轉染了陰性對照siRNA和未轉染siRNA的細胞作為對照。轉染48小時后，使用MTT法檢測siRNAs對細胞增殖的影響。轉染后6小時，更換加入含有不同濃度化療藥物的培養(yǎng)基，48小時后再檢測細胞增殖情況。
　　 結果：AP-4特異性siRNAs轉染AGS細胞后，AP-4的下調于24小時就已經出現(xiàn)，持續(xù)至96小時，且在48和72小時時沉默效率最高。在轉染48小時后，細胞的相對增殖率為：陰性對照組為98

5、.52±7.32％，AP-4-siRNA-1組為66.28±1.79％，AP-4-siRNA-2組為61.55±2.33％，差異有統(tǒng)計學意義。siRNAs聯(lián)合化療藥物作用于細胞，其相對的增殖抑制率為：5-Fu（10μg/ml）組：空白對照組為27.93±4.59％，陰性對照組為30.70±0.87％，AP-4-siRNA-1組為52.23±3.71％，AP-4-siRNA-2組為56.74±3.66％；5-Fu（20μg/ml）組：空白

6、對照組為51.77±2.82％，陰性對照組為49.03±2.31％，AP-4-siRNA-1組為73.80±4.64％，AP-4-siRNA-2組為75.11±2.67％；順鉑（0.5μg/ml）組：空白對照組為20.65±4.71％，陰性對照組為18.30±3.13％，AP-4-siRNA-1組為50.66±3.05％，AP-4-siRNA-2組為61.54±3.64％；順鉑（1.0μg/ml）組：空白對照組為45.24±0.77％，

7、陰性對照組為48.82±3.43％，AP-4-siRNA-1組為70.03±1.48％，AP-4-siRNA-2組為71.49±3.99％；阿霉素（0.4μg/ml）組：空白對照組為28.43±3.92％，陰性對照組為27.52±4.68％，AP-4-siRNA-1組為55.95±1.67％，AP-4-siRNA-2組為63.70±1.47％；阿霉素（0.6μg/ml）組：空白對照組為53.88±2.55％，陰性對照組為55.23±3.

8、26％，AP-4-siRNA-1組為77.36±4.35％，AP-4-siRNA-2組為79.57±3.69％，AP-4特異性siRNAs組的抑制率與陰性對照組和空白對照組之間進行比較，差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結論：AP-4的下調可以抑制細胞增殖，增加化療藥物對胃癌細胞的抑制作用，因此轉錄因子AP-4可能是促進胃癌發(fā)展，增加腫瘤細胞對化療藥物的耐藥性。
　　 第三部分下調AP-4的表達對胃癌細胞周期阻滯和凋亡的影響

9、r>　　 目的：探討AP-4的下調對胃癌細胞周期阻滯和凋亡的影響，并對其機制進行研究。
　　 方法：轉染48小時后，使用流式細胞儀檢測細胞周期阻滯和細胞凋亡情況，并且檢測細胞周期調控基因p21、p53和cyclin D1的表達，和凋亡相關基因Bcl-2、Bcl-xL、Bax、Caspase-8和Caspase-9的表達情況。
　　 結果：轉染48小時后，細胞周期分布為：空白對照組：G0/G1期48.44±2.35％，G

10、2/M期18.91±0.52％，S期32.65±1.02％；陰性對照組：G0/G1期50.38±2.47％，G2/M期18.44±0.43％，S期31.235±0.98％；siRNA-1組：G0/G1 期61.92±3.86％，G2/M期13.72±0.34％，S期24.36±0.96％；siRNA-2組：G0/G1 期63.67±3.31％，G2/M期13.42±0.37％，S期22.91±0.89％；轉染AP-4特異性siRNAs能

11、夠引起細胞周期阻滯于G0/G1期。進一步檢測細胞周期調控基因p21、p53和cyclin D1的表達，結果發(fā)現(xiàn)下調AP-4的表達能夠促進p21和p53的表達，而抑制cyclin D1的表達。轉染AP-4特異性siRNAs后，細胞的凋亡率有明顯的升高，AP-4特異性siRNAs組的凋亡率要明顯高于對照組；轉染后，AP-4特異性siRNAs組細胞的Bcl-2和Bcl-xL的mRNA水平明顯低于陰性對照組和空白對照組，而Bax、Caspase