miR-203a和miR-203b基因在食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及其甲基化狀態(tài)分析.pdf

1、目的:食管癌是發(fā)生在食管粘膜上皮的惡性腫瘤，根據(jù)食管癌的組織學(xué)特點可分為五種類型，其中食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cellcarcinoma，ESCC)在食管癌中所占比例最多，大約占90％，食管腺癌(esophageal adenocarcinoma，EA)次之，占7％左右，其他幾種類型均少見。我國是世界上食管癌發(fā)生率和病死率均較高的國家之一，同時食管癌預(yù)后特別差，晚期患者生存率極低。然而到目前為止，食管癌的

2、發(fā)病機(jī)制尚不清楚。
　　近年來對食管癌的發(fā)病機(jī)制已進(jìn)行廣泛研究，其中對表觀遺傳學(xué)的改變特別是miRNAs啟動子區(qū)高甲基化已成為研究的熱點，本研究通過檢測miR-203a和miR-203b基因在食管癌細(xì)胞和食管鱗癌組織中的表達(dá)及其甲基化狀態(tài)，探討miR-203a和miR-203b基因甲基化與食管癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，從而為食管癌發(fā)病的分子機(jī)制、治療方案及其評估預(yù)后等方面提供新的理論依據(jù)。
　　方法:
　　1、應(yīng)用實時定量R

3、T-PCR(Quantitative real-time RT-PCR，qRT-PCR)方法檢測應(yīng)用DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜-2'-脫氧胞苷(5-aza-2'-deoxycitydine，5-aza-dC)處理前后的食管癌細(xì)胞系(TE1、TE13、YES-2、ECa109和T.TN)和54例食管鱗癌組織及其相應(yīng)的癌旁組織中miR-203a和miR-203b基因的表達(dá)。
　　2、應(yīng)用甲基化特異性PCR(methylation

4、 specific polymerase chainreaction，MSP)方法檢測應(yīng)用5-aza-dC處理前后的食管癌細(xì)胞系和83例食管鱗癌組織及其相應(yīng)的癌旁組織中miR-203a和miR-203b基因的甲基化狀態(tài)。
　　3、運(yùn)用統(tǒng)計軟件SPSS19.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　結(jié)果:
　　1、miR-203a基因在食管癌中的表達(dá)及甲基化
　　1.1食管癌細(xì)胞系中miR-203a基因的表達(dá)及甲基化狀態(tài)

5、>　　未經(jīng)5-aza-dC處理，五種食管癌細(xì)胞中miR-203a基因的表達(dá)均相對較低，且呈高甲基化狀態(tài);5-aza-dC處理后，miR-203a基因的表達(dá)均顯著升高（均P＜0.05），YES-2細(xì)胞中miR-203基因甲基化程度顯著降低，其余4種食管癌細(xì)胞系中miR-203a基因為非甲基化狀態(tài)。
　　1.2食管癌組織中miR-203a基因的表達(dá)
　　miR-203a基因在食管癌和其相應(yīng)的癌旁組織的表達(dá)量分別為0.253±0.

6、099和0.481±0.189，食管癌組織miR-203a基因的表達(dá)量明顯低于其相應(yīng)的癌旁組織，兩者的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-14.137，P=0.000）。在食管鱗癌患者中，miR-203a的表達(dá)與腫瘤組織的腫瘤分期和分化程度有關(guān)(P＜0.05)，而與患者的年齡、性別和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)(P＞0.05)。
　　1.3食管癌組織中miR-203a基因甲基化狀態(tài)的研究
　　miR-203a基因啟動子區(qū)在食管鱗癌組織和其相應(yīng)的癌旁組

7、織的甲基化率分別62.7％(52/83)和7.2％(6/83)。食管鱗癌組織中miR-203a基因啟動子區(qū)甲基化發(fā)生率明顯高于其相應(yīng)的癌旁組織（x2=3.918，P=0.048）。miR-203a基因在低分化鱗癌組中甲基化發(fā)生率75.0％(33/44)明顯高于中高分化鱗癌組甲基化發(fā)生率48.7％(19/39)（x2=6.103，P=0.013）;Ⅲ期和Ⅳ期miR-203a基因啟動子區(qū)的甲基化發(fā)生率94.1％(16/17)明顯高于Ⅰ期和Ⅱ

8、期54.5％(36/66)（x2=9.047，P=0.003）;miR-203a基因啟動子區(qū)甲基化發(fā)生率與患者的年齡、性別和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)(P＞0.05)。
　　1.4食管癌組織中miR-203a基因的表達(dá)、甲基化狀態(tài)及其與臨床病理資料之間的關(guān)系
　　在miR-203a基因啟動子區(qū)發(fā)生甲基化的食管鱗癌組織中，其平均相對表達(dá)量為0.232±0.818，未發(fā)生甲基化的食管鱗癌組織中平均相對表達(dá)量為0.313±0.120，兩者差異

9、有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.006)。
　　2、miR-203b基因在食管癌中的表達(dá)及甲基化
　　2.1食管癌細(xì)胞系中miR-203b基因的表達(dá)及甲基化狀態(tài)
　　未經(jīng)5-aza-dC處理的5種食管癌細(xì)胞系中miR-203b基因的表達(dá)均相對較低，同時表現(xiàn)為高甲基化狀態(tài);而應(yīng)用5-aza-dC處理后，miR-203b在YES-2和T.TN細(xì)胞中的甲基化程度降低，非甲基化程度增加，其余3種食管癌細(xì)胞系中miR-203b基因均表現(xiàn)為

10、非甲基化狀態(tài)。
　　2.2食管癌組織中miR-203b基因的表達(dá)
　　miR-203b基因在食管癌和其相應(yīng)的癌旁組織的表達(dá)量分別為0.026±0.021和0.049±0.041，食管癌組織miR-203b基因的表達(dá)明顯低于其相應(yīng)的癌旁組織，兩者的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.810，P=0.000)。在食管鱗癌患者中，miR-203b的表達(dá)與腫瘤組織的分化程度有關(guān)(P＜0.05)，而與患者的年齡、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤組織的分期

11、無關(guān)（P＞0.05）。
　　2.3食管癌組織中miR-203b基因甲基化狀態(tài)的研究
　　miR-203b基因啟動子區(qū)在食管鱗癌組織和其相應(yīng)的癌旁組織中的甲基化率分別57.8％(48/83)和12.0％(10/83)。食管鱗癌組織中miR-203b基因啟動子區(qū)甲基化發(fā)生率明顯高于其相應(yīng)的癌旁組織（x2=6.673，P=0.010）。miR-203b基因在低分化鱗癌組甲基化發(fā)生率68.2％(30/44明顯高于中高分化鱗癌組甲基化

12、發(fā)生率46.2％(18/39)（x2=4.114，P=0.043）;miR-203b基因啟動子區(qū)甲基化發(fā)生率與年齡、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤組織分期無關(guān)（P＞0.05）。
　　2.4食管癌組織中miR-203b基因的表達(dá)、甲基化狀態(tài)及其與臨床病理資料之間的關(guān)系
　　在miR-203b基因啟動子區(qū)發(fā)生甲基化的食管鱗癌組織中，其平均相對表達(dá)量是0.017±0.013，未發(fā)生甲基化的食管鱗癌組織中平均相對表達(dá)量是0.036±0.02

13、5，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001)。
　　結(jié)論:
　　1、miR-203a和miR-203b在食管癌細(xì)胞系中表達(dá)較低，且呈現(xiàn)為高甲基化狀態(tài)，5-aza-dC能逆轉(zhuǎn)miR-203a和miR-203b基因的甲基化，使miR-203a和miR-203b恢復(fù)表達(dá)，提示miR-203a和miR-203b基因啟動子區(qū)異常甲基化有可能是導(dǎo)致它們在食管癌細(xì)胞中表達(dá)缺失的重要機(jī)制之一。
　　2、miR-203a和miR-203b

14、基因在食管鱗癌組織中的表達(dá)明顯低于其相應(yīng)的癌旁組織，提示miR-203a和miR-203b基因在食管鱗癌中可能主要起抑癌基因的作用。
　　3、食管鱗癌組織中miR-203a和miR-203b基因啟動子區(qū)甲基化情況明顯高于其相應(yīng)的癌旁組織，提示miR-203a和miR-203b基因甲基化可能是食管鱗癌發(fā)生的機(jī)制之一。
　　4 miR-203a和miR-203b啟動子區(qū)甲基化情況與患者年齡，性別等因素?zé)o關(guān)，與分化程度等生物學(xué)行為