水甘油通道蛋白7、9在非酒精性脂肪肝病中治療與預(yù)防作用的研究.pdf

1、目的:構(gòu)建pEGFP-N1-AQP7、pEGFP-N1-AQP9及pshRNA-AQP9重組質(zhì)粒,驗(yàn)證其在COS-7細(xì)胞中的表達(dá)情況,檢測(cè)其對(duì)L-02細(xì)胞AQP9表達(dá)的影響及其對(duì)L-02細(xì)胞脂肪變性的的作用,利用電穿孔的方法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入減毒沙門氏菌構(gòu)建重組SL7207疫苗株,為AQP7及AQP9在非酒精性脂肪肝病的基因治療奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:(1)從人脂肪組織及肝臟組織中提取總RNA,通過RT-PCR獲得AQP7及AQ

2、P9基因,將其克隆到pEGFP-N1質(zhì)粒上,構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGFP-N1-AQP7及pEGFP-N1-AQP9,將其轉(zhuǎn)染COS-7真核表達(dá)細(xì)胞,通過觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)、RT-PCR和Western blot檢測(cè)其在COS-7中的表達(dá);(2)構(gòu)建針對(duì)人AQP9的干擾質(zhì)粒pshRNA-AQP9,將其轉(zhuǎn)染L-02肝細(xì)胞,通過RT-PCR和Western blot檢測(cè)其抑制效率;(3)將pEGFP-N1-AQP9及pshRNA-AQP9分別

3、轉(zhuǎn)染油酸誘導(dǎo)脂肪變性的L-02細(xì)胞,檢測(cè)其對(duì)L-02細(xì)胞脂肪變性的作用;(4)通過電穿孔的方法將pEGFP-N1-AQP9及pshRNA-AQP9轉(zhuǎn)化減毒沙門氏菌SL7207并檢驗(yàn)其表達(dá)情況和穩(wěn)定性。
　　 結(jié)果:(1)通過RT-PCR獲得AQP7及AQP9基因片斷,成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGFP-N1-AQP7及pEGFP-N1-AQP9,驗(yàn)證了其在COS-7細(xì)胞中表達(dá)并與綠色熒光蛋白融合;(2)成功構(gòu)建pshRNA-AQP9,并

4、篩選出對(duì)L-02細(xì)胞AQP9干擾效果明顯的重組質(zhì)粒;(3)成功建立L-02細(xì)胞脂肪變性模型,pEGFP-N1-AQP9及pshRNA-AQP9對(duì)其脂肪變性程度分別有加重及減輕作用;(4)成功構(gòu)建重組SL7207疫苗株SL7207/pEGFP-N1-AQP9及SL7207/pshRNA-AQP9。
　　 結(jié)論:通過油酸誘導(dǎo)建立L-02肝細(xì)胞脂肪變性模型,轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-AQP9上調(diào)其AQP9的表達(dá)可使其脂肪變性程度加重,反之