釀酒酵母PMT4基因缺失影響細(xì)胞復(fù)制壽命和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的研究.pdf

1、[目的]：
　　釀酒酵母蛋白質(zhì)-O-甘露糖轉(zhuǎn)移酶(Protein-O-mannosyltransferase，PMT)家族共有七個(gè)成員(Pmt1p-Pmt7p)，這些成員從酵母到哺乳動(dòng)物都存在一定的保守性。PMT家族蛋白都定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，主要通過(guò)調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)，參與調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)平衡。研究顯示UPR和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在多種物種的衰老和衰老相關(guān)疾病的發(fā)生和發(fā)展

2、中具有重要作用。
　　研究表明PMT7缺失（與PMT家族其他成員同源性不高）延長(zhǎng)酵母復(fù)制壽命。本論文擬構(gòu)建PMT4基因缺失和過(guò)表達(dá)酵母菌株為基礎(chǔ)，以研究PMT4對(duì)酵母細(xì)胞復(fù)制壽命的影響，并著重從UPR信號(hào)通路與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激之間的關(guān)系入手探討PMT4調(diào)控酵母細(xì)胞復(fù)制壽命的潛在分子機(jī)制。
　　[方法]：
　　1.依據(jù)基因同源重組的原理，采用一步基因置換法構(gòu)建PMT4基因缺失(pmt4△)酵母菌株;通過(guò)線性化載體整合酵母基因組

3、DNA的方法，構(gòu)建PMT4基因過(guò)表達(dá)（PMT4-ox）酵母菌株;
　　2.在Scope AⅠ光學(xué)顯微鏡下，用玻璃纖維針對(duì)酵母母細(xì)胞和子細(xì)胞進(jìn)行分離，并計(jì)數(shù)子細(xì)胞數(shù)量，統(tǒng)計(jì)分析pmt4△菌株和PMT4-ox菌株酵母細(xì)胞復(fù)制壽命，研究PMT4是否參與調(diào)控酵母細(xì)胞的復(fù)制壽命;采用RT-PCR檢測(cè)pmt4△菌株中HAC1 mRNA的剪接情況，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)UPR通路中部分靶基因的轉(zhuǎn)錄水平。以探討PMT4調(diào)控酵母細(xì)胞復(fù)制壽命與UPR

4、信號(hào)通路的關(guān)系;
　　3.依據(jù)基因同源重組的原理成功構(gòu)建PMT4與HAC1或IRE1雙基因缺失(pmt4△hac1△和pmt4△ire1△)酵母菌株。用衣霉素劑作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的誘導(dǎo)劑，通過(guò)克隆形成實(shí)驗(yàn)方法觀察pmt4△菌株對(duì)細(xì)胞應(yīng)激的抗性。研究酵母內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激能力與UPR信號(hào)通路的關(guān)系，進(jìn)而探討酵母細(xì)胞復(fù)制壽命與應(yīng)激能力之間的調(diào)控關(guān)系。
　　[結(jié)果]：
　　1.成功構(gòu)建PMT4基因缺失酵母菌株和PMT4過(guò)表達(dá)(pmt4△

5、和PMT4-ox)酵母菌株;
　　2.與野生型酵母菌株比較，pmt4△菌株縮短酵母細(xì)胞的復(fù)制壽命(縮短27％，P＜0.0001)，而PMT4-ox菌株復(fù)制壽命無(wú)明顯變化（P＞0.05）。pmt4△菌株中HAC1mRNA無(wú)明顯剪接活性，UPR信號(hào)通路中下游靶基因(EUG1、LHS1、KAR2、ERO1、FKB2)表達(dá)無(wú)明顯變化;
　　3.成功構(gòu)建PMT4與HAC1或IRE1雙基因缺失(pmt4△ire1△和pmt4△hac1△