人類激酶RIOK3的功能研究.pdf

1、蛋白激酶是負責催化磷酸基團向絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸的轉(zhuǎn)移,在細胞內(nèi)信號傳導過程中發(fā)揮重要作用,在對體內(nèi)各種生理活動調(diào)控中扮演重要角色。RIOK3含有一個RIO結(jié)構(gòu)域,是人類RIO蛋白激酶家族成員,但是其結(jié)構(gòu)與其他RIO家族成員結(jié)構(gòu)上差別較大。關(guān)于人類RIO家族的功能尚未見報導,本文首次對人類RIO家族成員功能進行了研究。
　　 通過細胞定位實驗發(fā)現(xiàn)RIOK3定位于細胞質(zhì)中,利用流式細胞儀檢測細胞周期,發(fā)現(xiàn)過表達RIOK3野生型和

2、突變體對細胞周期都沒有影響。為了研究RIOK3的功能和分子機制,利用酵母雙雜交篩選首次得到四個與RIOK3相互作用的蛋白:CASP10(caspase-10),BIM(Bcl-2 interacting mediator),PAK2(p21-activated kinase 2)和CDC42(cell division cycle 42。本文著重對RIOK3與CASP10和BIM的相互作用進行了深入研究。
　　 CASP10是凋

3、亡途徑中的起始者,其N端兩個DED結(jié)構(gòu)域可以激活NFκB信號通路。本文首先利用GSTpull-down實驗、細胞內(nèi)免疫共沉淀實驗和熒光共定位實驗進一步證實了RIOK3和CASP10的相互作用。隨后通過系列缺失實驗發(fā)現(xiàn)RIOK3的RIO結(jié)構(gòu)域介導了它和CASP10的相互作用,RIOK3可以同時和CASP10的N端和C端的兩個DED結(jié)構(gòu)域相互作用,單獨的RIO結(jié)構(gòu)域不能與任何一個DED結(jié)構(gòu)域相互作用,需要其N端序列的協(xié)助。為了驗證相互作用的

4、特異性,用免疫共沉淀實驗檢測了其他含有RIO結(jié)構(gòu)域或者兩個DED結(jié)構(gòu)域而且結(jié)構(gòu)上非常相似的蛋白與對應蛋白的相互作用情況,均未發(fā)現(xiàn)相互作用。根據(jù)RIOK3與CASP10相互作用的提示,本文首次發(fā)現(xiàn)了RIOK3作為一個NFκB通路的新成員可以抑制TNFα誘導的NFκB的活化并證明了這種抑制效應是通過RIOK3與CASP10的相互作用而實現(xiàn)的:當轉(zhuǎn)入不與CASP10相互作用的RIOK3的截短體RIOK3N1時,抑制效應就會消失,而當轉(zhuǎn)入能與C

5、ASP10相互作用的截短體RIOK3N2時,抑制效應又得到恢復。本文又進一步證明RIOK3之所以與CASP10相互作用后抑制NFκB通路的激活是因為RIOK3可以與RIP和NIK競爭性結(jié)合CASP10,從而抑制CASP10在NFκ3通路中的作用。本文還首次發(fā)現(xiàn)了RIOK3也可以抑制RIP和NIK對NFκB通路的激活,可能也是因為RIOK3競爭性結(jié)合CASP10而引起的。
　　 BIM是一種只含一個BH3結(jié)構(gòu)域的蛋白,BIM的活化

6、可以促進細胞發(fā)生凋亡。本文利用免疫共沉淀實驗和熒光共定位實驗進一步驗證了RIOK3和BIM的相互作用。本文還首次發(fā)現(xiàn)了BIM能特異性地促進RIOK3蛋白降解,但不促進無關(guān)蛋白PAK2降解。本文通過將RIOK3與BIM共轉(zhuǎn)染細胞,發(fā)現(xiàn)隨著細胞中表達蛋白的增多,BIM促進RIOK3的降解作用也越來越明顯,但BIM促進RIOK3的降解并不依賴于泛素化-蛋白酶體途徑。
　　 本論文通過對RIOK3的功能研究,首次發(fā)現(xiàn)了RIOK3在NFκ