棉花絲裂原活化蛋白激酶基因GbMPK3的功能鑒定.pdf

1、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號級聯(lián)廣泛存在于各種真核生物體內(nèi)，在細胞信號傳導的過程中具有重要作用。本研究從海島棉Hai7124根系中分離到一個在受黃萎病菌侵染時上調(diào)表達的MAPK類基因GbMPK3，并分別在本氏煙和陸地棉YZ1中對其在植物抗非生物脅迫和生物脅迫中的功能和調(diào)控機理進行了分析，取得的主要結(jié)果如下:
　　1.GbMPK3的克隆及序列分析
　　從海島棉Hai7124受黃萎病菌V991處理的RNA-seq數(shù)據(jù)庫中分

2、離到一條在黃萎病菌侵染時表達量明顯變化的EST序列(CL1Contig1773)，通過RACE和Genome-walking獲得該基因的全長和啟動子序列。氨基酸序列比對和系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn)其編碼的蛋白具有MAPK的典型特征，屬于MAPK基因家族TEY亞家族A組的成員，并與擬南芥MPK3的同源度為68％，因此將其命名為GbMPK3。將GbMPK3蛋白的N端融合GFP，瞬時轉(zhuǎn)化煙草表皮細胞，結(jié)果顯示GbMPK3蛋白主要定位于細胞核。

3、　　2.GbMPK3的表達模式分析
　　利用RT-PCR和qPCR分析了GbMPK3的表達模式。結(jié)果表明GbMPK3的表達水平較低且具有組織特異性，在根系、花瓣、花藥和纖維中表達量相對較高。GbMPK3在棉花根系中的表達還受到冷、高溫、鹽、甲基紫精(MV)和脫水等非生物逆境、水楊酸(SA)等激素以及黃萎病菌侵染的誘導。
　　3.超量表達GbMPK3提高了煙草對干旱和氧化脅迫的耐受性
　　構(gòu)建了GbMPK3基因超量表達載

4、體并分別轉(zhuǎn)化煙草和棉花。通過抗性篩選和分子鑒定分別獲得了高量表達GbMPK3的轉(zhuǎn)基因煙草和棉花株系。對野生型和轉(zhuǎn)基因煙草在成株期進行干旱脅迫處理，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草具有更強的耐旱性。表現(xiàn)為轉(zhuǎn)基因系復水之后的株高和存活率顯著高于野生型。生理生化分析發(fā)現(xiàn)超表達GbMPK3提高了煙草在干旱脅迫下抗氧化酶APX的基因表達和酶活性，從而減少了煙草細胞內(nèi)的活性氧積累。用MV處理煙草種子和成株期煙草葉片，發(fā)現(xiàn)MV對野生型和轉(zhuǎn)基因系都造成了氧化脅迫，但是野

5、生型對MV更敏感。MV處理之后野生型煙草種子的萌發(fā)率和成株期葉盤的葉綠素含量均顯著低于轉(zhuǎn)基因植株。RT-PCR分析結(jié)果顯示，GbMPK3超表達的煙草在MV處理后抗氧化酶APX的基因表達量高于野生型。推測超量表達GbMPK3增強煙草對干旱和氧化脅迫的耐受性可能與提高抗氧化酶的表達和活性有關(guān)。
　　4.超量表達GbMPK3影響了煙草對煙草花葉病毒(TMV)和灰霉病菌的抗性
　　對超量表達GbMPK3基因的煙草轉(zhuǎn)基因系和野生型進行

6、病原菌接種處理。轉(zhuǎn)基因煙草對TMV的抗性增強，超表達GbMPK3降低了TMV在煙草中擴散和繁殖的速率;而接種灰霉病菌后轉(zhuǎn)基因煙草則表現(xiàn)出更感病的表型。
　　5.超量表達GbMPK3降低了煙草和棉花對黃萎病菌的抗性
　　對超量表達GbMPK3的煙草和棉花轉(zhuǎn)基因材料進行黃萎病菌接種實驗，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草和棉花的抗病性都顯著降低。受黃萎病菌侵染后，野生型和轉(zhuǎn)基因材料都表現(xiàn)出葉片萎蔫、黃化等黃萎病的典型病征，但野生型的葉片黃化與萎蔫出

7、現(xiàn)的時期晚于轉(zhuǎn)基因系，具體表現(xiàn)為野生型的發(fā)病率和病指顯著低于轉(zhuǎn)基因系。利用VIGS方法抑制棉花中GbMPK3的表達，對GbMPK3沉默的棉花進行接種實驗。接種黃萎病菌后，對照材料和抑制GbMPK3表達的材料之間沒有觀察到抗病性的差異，兩者在葉片黃化和脫落程度上無明顯區(qū)別。說明抑制GbMPK3表達對棉花抗黃萎病的影響不大，而超量表達GbMPK3顯著減弱了植物對黃萎病菌的抗病性。
　　6.GbMPK3影響黃萎病菌侵染下棉花SA相關(guān)基因

8、的表達
　　qPCR分析顯示，無論是GbMPK3抑制表達、GbMPK3超量表達還是野生型的棉花根系中SA相關(guān)基因，如WRKY70、PR1和PR5等，在接種5天后相對于接水處理的對照組都顯著上調(diào)。與野生型相比，GbMPK3超量表達轉(zhuǎn)基因系中WRKY70、PR1和PR5等基因的表達水平顯著升高;而抑制GbMPK3表達并未影響PR1和PR5的表達。這些結(jié)果說明棉花品種YZ1受黃萎病菌侵染后SA路徑被激活，GbMPK3的超量表達增強了SA