過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ及其配體在防治腹膜透析相關(guān)腹膜纖維化中作用及機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、前言：
　　 腹膜透析(peritoneal dialysis，P D)是終末期腎臟病的主要替代療法，具有血液透析(hemodialysis，HD)無(wú)法替代的優(yōu)勢(shì)。傳統(tǒng)的用于PD的腹膜透析液具有非生理性的高濃度葡萄糖、高滲、低PH值等特點(diǎn)。腹膜間皮細(xì)胞(peritoneal mesothelialcells，PMC)是腹膜表面的一層細(xì)胞，是腹膜透析時(shí)與腹膜透析液直接接觸的第一道生理屏障，高濃度葡萄糖糖可調(diào)節(jié)PD期間PMC的代謝，

2、抑制PMC的生長(zhǎng)和再生，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factorβ，TGF-β)基因表達(dá)，促進(jìn)氧化損傷和增加終末糖基化產(chǎn)物，這些因素均促進(jìn)腹膜纖維化。高糖對(duì)腹膜間皮細(xì)胞的損傷是PD相關(guān)腹膜纖維化的始動(dòng)因素，也是研究PD相關(guān)腹膜纖維化的主要切入點(diǎn)。目前高濃度葡萄糖損傷腹膜間皮細(xì)胞的機(jī)制尚未完全闡明。
　　 過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator activato

3、rγ，PPARγ)是配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子，屬于Ⅱ型核受體超家族成員。通過(guò)與其DNA上的應(yīng)答元件結(jié)合以及與活化蛋白-1(activator protein-1，AP-1)、核因子kappaB(nuclearfactor-kappaB，NF-κB)等相互作用，在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)相應(yīng)的目標(biāo)基因表達(dá)，PPARγ最先被定義為調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞特定基因表達(dá)和誘導(dǎo)前脂肪細(xì)胞分化的轉(zhuǎn)錄因子。目前認(rèn)為，PPARγ在保護(hù)心血管損傷、抑制炎癥反應(yīng)、控制腫瘤生長(zhǎng)、抗纖

4、維化中起關(guān)鍵作用。PPARγ活化后可調(diào)控多種細(xì)胞因子的生成，如結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（connective tissue growth fator，CTGF）、纖溶酶原激活抑制因子-1(plasminogenactivator inhibitor1，PAI-1)、腫瘤壞死因子、單核細(xì)胞趨化蛋白-1等。活化的PPARγ可減少上述細(xì)胞因子的生成，產(chǎn)生抗炎癥及抗纖維化效應(yīng)。
　　 CTGF和PAI-1是重要的促纖維化因子，在多種纖維化病變中

5、表達(dá)上調(diào)。CTGF作為T(mén)GF-β的重要下游因子，介導(dǎo)TGF-β的促纖維化作用，高糖可促進(jìn)PMC分泌CTGF，CTGF作用于PMC本身及間質(zhì)成纖維細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，增加細(xì)胞外基質(zhì)的合成和積聚，促進(jìn)腹膜纖維化。PAI-1是纖溶酶原激活物的主要抑制劑，能抑制纖溶酶，從而抑制金屬蛋白酶，減少細(xì)胞外基質(zhì)的降解。PD時(shí)，高濃度葡萄糖促進(jìn)PMC PAI-1的表達(dá)，抑制細(xì)胞外基質(zhì)的降解，在PD相關(guān)腹膜纖維化發(fā)生中起重要作用。
　　 PMC結(jié)

6、構(gòu)性表達(dá)PPARγ，PPARγ在PMC的功能尚不清楚。本研究用腹透液相關(guān)濃度葡萄糖處理PMC，觀察PPARγ表達(dá)的變化，以及PPARγ配體吡格列酮(pioglitazone，Pio)和15-脫氧前列腺素J2(15-deoxy-deta12，14-prostaglandinJ2，15 d-PGJ2)對(duì)高糖條件下PMC CTGF、PAI-1表達(dá)及對(duì)AP-1、NF-κB途徑活性的影響，探討PPARγ及其配體在PD相關(guān)腹膜纖維化中的作用及機(jī)制，

7、為PD相關(guān)腹膜纖維化的防治提供新的思路。
　　 方法：
　　 1、組織來(lái)源:雄性Wistar大鼠數(shù)只，體重140±20g，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。
　　 2、細(xì)胞培養(yǎng):胰蛋白酶消化法分離培養(yǎng)PMC，倒置相差顯微鏡、免疫細(xì)胞化學(xué)方法對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行鑒定。
　　 3、在高糖作用下，用RT-PCR法檢測(cè)PMC PPARγmRNA的表達(dá)情況;用Westernblot法檢測(cè)PMC PPARγ蛋白

8、的表達(dá)情況。
　　 細(xì)胞分組:
　　 (1)不同濃度葡萄糖組:1.5、2.5、4.25％;
　　 (2)2.5％葡萄糖作用不同時(shí)間組:0、6、12、24、36、48、72h;
　　 (3)不同濃度甘露醇組:1.5、2.5、4.25％。
　　 4、在吡格列酮和15-脫氧前列腺素J2的作用下，用RT-PCR法檢測(cè)CTGF、PAI-1、c-fos、c-jun mRNA的表達(dá)情況;用Western blo

9、t法檢測(cè)PMC CTGF、PAI-1、I-κBα、NF-κBp65蛋白表達(dá)的情況。
　　 細(xì)胞分組:
　　 (1)不同濃度(5、15μM)吡格列酮預(yù)孵育2h，加入2.5％葡萄糖再作用24h;
　　 (2)不同濃度(5、15μM)15d-PGJ2預(yù)孵育2h，加入2.5％葡萄糖再作用24h。
　　 5、在NF-κB抑制劑二硫氨基甲酸吡咯烷(Ammonium pyrrolidinedithiocarbomate

10、，PDTC)和AP-1抑制劑姜黃素(curcumin，Cur)作用下，Western blot法檢測(cè)PMC CTGF、PAI-1蛋白表達(dá)的情況。
　　 細(xì)胞分組:
　　 (1)不同濃度(25、50μM) PDTC預(yù)孵育2h，加入2.5％葡萄糖再作用24h;
　　 (2)不同濃度(15、30μM)姜黃素預(yù)孵育2h，加入2.5％葡萄糖再作用24h。
　　 結(jié)果:
　　 1、葡萄糖抑制PMC表達(dá)PPAR

11、γ
　　 1.5％的葡萄糖可抑制PPARγmRNA和蛋白的表達(dá)，4.25％葡萄糖的作用最強(qiáng)，2.5％的葡萄糖作用6h時(shí)PPARγmRNA和蛋白表達(dá)減少，72h時(shí)PPARγmRNA和蛋白表達(dá)最少，與葡萄糖相同濃度的甘露醇對(duì)PMC PPARγmRNA和蛋白表達(dá)無(wú)影響。
　　 2、吡格列酮和15d-PGJ2對(duì)高糖誘導(dǎo)PMC CTGF、PAI-1達(dá)的影響
　　 2.5％葡萄糖增加PMC CTGF、PAI-1的表達(dá)，吡格列

12、酮和15-脫氧前列腺素J2均可減少高糖條件下PMC CTGF、PAI-1的表達(dá)。
　　 3、PDTC和姜黃素對(duì)高糖誘導(dǎo)PMC CTGF、PAI-1表達(dá)的影響
　　 PDTC和姜黃素預(yù)處理PMC后，抑制了高糖誘導(dǎo)的CTGF、PAI-1蛋白的表達(dá)。
　　 4、吡格列酮和15d-PGJ2對(duì)高糖條件下PMC NF-κB和AP-1信號(hào)途徑的影響
　　 2.5％葡萄糖減少胞漿中I-κBα蛋白表達(dá)，增加胞核中NF-κB

13、p65蛋白的表達(dá)，吡格列酮和15d-PGJ2增加高糖條件下I-κBα蛋白的表達(dá)，減少胞核內(nèi)NF-κBp65蛋白的表達(dá)，抑制NF-κB進(jìn)入胞核從而抑制其轉(zhuǎn)錄活性;2.5％葡萄糖增加AP-1亞單位c-fos、c-jun mRNA的表達(dá)，吡格列酮和15-脫氧前列腺素J2抑制高糖條件下c-fos、c-jun mRNA的表達(dá)。
　　 結(jié)論:
　　 1、葡萄糖抑制PMC PPARγmRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)呈濃度和時(shí)間依賴性;
　

14、　 2、高濃度葡萄糖抑制PMC PPARγmRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)與其產(chǎn)生的高滲透壓無(wú)關(guān);
　　 3、PPAR配體吡格列酮和15d-PGJ2抑制高糖誘導(dǎo)PMC CTGF、PAI-1的表達(dá)，激活PPARγ可能在防治PD相關(guān)腹膜纖維化中發(fā)揮作用;
　　 4、高糖可能通過(guò)NF-κB和AP-1途徑促進(jìn)PMC表達(dá)CTGF、PAI-1;
　　 5、激活PPARγ可能通過(guò)與NF-κB和AP-1途徑相互作用抑制高糖條件下PMC表