過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ在非酒精性脂肪性肝炎發(fā)病機(jī)制中作用的研究.pdf

1、目的：非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)是由于肝內(nèi)脂質(zhì)沉積而引起的肝細(xì)胞壞死、炎癥和纖維化等肝損傷，是非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fattyliver disease，NAFLD)由單純性肝脂肪變向肝硬化甚至肝癌進(jìn)展的重要階段，NASH導(dǎo)致的肝硬化具有與乙、丙型肝炎肝硬化相同的不良預(yù)后。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)其日益關(guān)注，研究不斷深入，但其病因及發(fā)病機(jī)制仍不十分清楚，在防治上亦

2、缺乏有效手段。目前認(rèn)為胰島素抵抗(insulin resistence，IR)是NASH發(fā)病的重要因素之一，改善胰島素抵抗可能有助于防止本病的進(jìn)展。羅格列酮作為過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferators-activated receptor gamma，PPARγ)的高親和力激動(dòng)劑，能明顯增強(qiáng)組織對(duì)胰島素的敏感性。PPARγ屬于甾體激素類受體超家族中的細(xì)胞核受體家族成員，人體內(nèi)。PPARγ在肝臟、肌肉

3、均有表達(dá)，PPARγ在NASH發(fā)病中的作用及其機(jī)制目前尚未明確。本研究采用高脂、膽堿一蛋氨酸缺乏(high fat，methionine and cholinedeficient diet，MCD)飲食建立小鼠NASt{模型，應(yīng)用PPAγ激動(dòng)劑羅格列酮干預(yù)治療，以逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈反應(yīng)(ReverseTfanscription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)方法和Western blot法研究PPARγ

4、、腫瘤壞死因子a(tumor necrosisfactor-a，TNF-a)在NASH小鼠肝組織中的表達(dá)情況及其與病情進(jìn)展的關(guān)系，以探討PPARγ被羅格列酮激活后，PPARγ在NASH發(fā)病中的作用及其機(jī)制，是否可抑制TNF-a的表達(dá)，延緩或阻止NASH的進(jìn)展，以進(jìn)一步揭示改善胰島素抵抗在NASH中的作用，為有效防治本病提供新的思路。 方法：選用健康雄性C57BL6/J小鼠15只，隨機(jī)分為3組，每組5只。模型組采用MCD飼料，對(duì)照

5、組給予膽堿、蛋氨酸充足的飼料，羅格列酮干預(yù)組以MCD飼料加羅格列酮(50mg/kg/d)，喂養(yǎng)3周。血清甘油三酯(triglyceride，TG)，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotrans。ferase，ALT)采用日本Olympus AU 2700全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定；肝組織病理學(xué)變化采用蘇木精.伊紅(hematoxvlin-eosin，H＆E)染色觀察；肝組織PPARγ，mRNA及TNF-a mRNA和蛋白表達(dá)分別采用

6、RT-PCR和Western blot檢測(cè)。 結(jié)果： 1、動(dòng)物一般情況：對(duì)照組小鼠活潑、毛發(fā)有光澤，體重逐漸增加。模型組和羅格列酮干預(yù)組小鼠體重均下降，尤以模型組明顯。對(duì)照組小鼠體重、肝濕重均較模型組和干預(yù)組增加顯著(分別為25.20±1.10、16.80±2.28、17.60±0.89，0.12±0.01、0.07±0.01、0.07±0.01，P<0.05)，模型組體重、肝重與羅格列酮干預(yù)組相比差異無(wú)顯著性意義。肝臟

7、指數(shù)：對(duì)照組顯著高于羅格列酮干預(yù)組(0.47±0.04，0.37±0.07，P<0.05)，模型組與對(duì)照組、干預(yù)組差別無(wú)顯著性意義。 2、血清生化學(xué)改變：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物ALT水平模型組>羅格列酮干預(yù)組>對(duì)照組，依次為：211.00±12.73、99.75±10.97、48.33±11.59，P<0.01；血清TG水平模型組>對(duì)照組>羅格列酮干預(yù)組，依次為：0.73±0.04、0.53±0.14、0.30±0.07，P<0.01。

8、 3、肝臟病理學(xué)變化：肉眼觀察：對(duì)照組小鼠肝臟為紅褐色，明亮有光澤。模型組小鼠肝臟體積明顯減小，整個(gè)肝臟呈淺黃色，與周圍組織有粘連，切面油膩、無(wú)光澤。羅格列酮干預(yù)組小鼠肝臟體積亦有縮小，為紅褐色、有光澤。光鏡下觀察：對(duì)照肝組織切片肝小葉結(jié)構(gòu)基本正常；模型組肝細(xì)胞濁腫，形成以大泡性為主的肝細(xì)胞脂肪變，以腺泡3帶最為明顯，肝竇變窄，小葉內(nèi)可見點(diǎn)狀或灶狀肝細(xì)胞壞死伴有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，以單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞為主，并有少量中性粒細(xì)胞(F2-3、G1

9、～2、S1)。羅格列酮干預(yù)組小鼠肝損傷較模型組明顯減輕，肝細(xì)胞輕度腫脹，脂肪變輕微(FO～1、GO、SO)，未見明顯肝細(xì)胞壞死及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。 4、肝組織PPARγmRNA的表達(dá)：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝組織PPARγmRNA表達(dá)水平依次為：羅格列酮干預(yù)組>模型組>對(duì)照組(0.83±0.01、0.75±0.01、0.72±0.01，P<0.01)，差異具有顯著性意義。 5、肝組織PPARγ蛋白表達(dá)情況：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝組織PPARγ蛋白水平

10、表達(dá)與mRNA表達(dá)一致，依次為：羅格列酮干預(yù)組>模型組>對(duì)照組(0.77±0.00、0.69±0.02、0.49±0.01，P<0.01)，差異具有顯著性意義。 6、肝組織TNF-a mRNA表達(dá)情況：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝組織TNF-a mRNA表達(dá)水平依次為：模型組>羅格列酮干預(yù)組>對(duì)照組(1.11±0.01、0.99±0.02、0.91±0.00.P<0.01)，差異具有顯著性意義。 7、小鼠肝組織TNF-a蛋白表達(dá)情況：實(shí)驗(yàn)

11、動(dòng)物肝組織TNF-a蛋白表達(dá)水平依次為：模型組>羅格列酮干預(yù)組>對(duì)照組(0.99±0.01、0.60±0.01、0.47±0.01，P<0.01)，差異具有顯著性意義。 結(jié)論： 1、高脂、膽堿．蛋氨酸缺乏飲食3周可誘導(dǎo)具有典型NASH臨床特征的肝損傷動(dòng)物模型，此模型符合人類NASH發(fā)病的病理學(xué)特點(diǎn)。 2、PPARγ和TNF-a在NASH模型中的表達(dá)存在一致變化，推測(cè)PPARγ mRNA及蛋白表達(dá)增多為機(jī)體的一種代