microRNA-30e在膿毒癥急性肺損傷中的表達及其調節(jié)炎癥反應機制的研究.pdf

1、目的:1.探討膿毒癥大鼠受損肺組織及脂多糖誘導的大鼠肺泡巨噬細胞不同時間點miR-30e的表達及其與炎癥因子表達的相關性;
　　2.探討被上調或下調的miR-30e對LPS誘導的巨噬細胞炎癥反應發(fā)揮的作用;
　　3.初步探討上調或下調的miR-30e對LPS誘導的巨噬細胞炎癥反應發(fā)揮作用的機制。
　　方法:1.建膿毒癥大鼠模型，觀察大鼠一般情況，采集肺組織標本，分析肺組織病理結構的變化，判斷模型是否構建成功。用RT-q

2、PCR方法檢測膿毒癥大鼠肺組織中miR-30e和炎癥指標的表達情況，并分析兩者的相關性;
　　2.構建NR8383細胞（肺泡巨噬細胞）的膿毒癥模型，在LPS刺激的NR8383細胞0h、3h、6h、12h、24h五個時間點檢測miR-30e和炎癥因子表達水平的變化，并分析兩者的相關性;
　　3.采用microRNA靶基因預測軟件Targetscan和RNAhybrid數據庫對rno-miRNA-30e-5p進行靶基因預測，以兩

3、個或以上軟件共同預測結果作為其候選靶基因。對miR-30e及靶基因進行生物信息學分析，預測其結合位點及相關信號通路，在LPS處理的肺泡巨噬細胞中用Western Blot方法檢測靶蛋白的表達;
　　4.將miR-30e mimics/inhibitor轉染至NR8383細胞，用RT-qPCR方法檢測炎癥因子的mRNA水平的表達改變，ELISA法檢測炎癥因子的蛋白水平表達改變，并用Western Blot檢測靶蛋白的表達;
　

4、　5.統(tǒng)計方法:用SPSS23.0統(tǒng)計軟件分析數據，計量資料用均數±標準差（(x)±S）表示，多組樣本均數比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05，為差異有統(tǒng)計學意義。相關性檢驗，當雙變量都服從正態(tài)分布時采用Pearson相關分析，不服從時則采用Spearman相關分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果:1.大鼠膿毒癥模型的建立及肺組織的病理改變。正常對照組大鼠一般情況良好，活動自如，呼吸平穩(wěn)

5、，飲食飲水未見異常，對外界刺激的反應正常。LPS處理組大鼠在LPS注射后30分鐘開始出現躁動不安，心率、呼吸頻率顯著加快;LPS注射后3小時，呼吸急促癥狀明顯，四肢、唇鼻紫紺，體溫上升，并出現精神反應差、蜷縮懶動、肌張力下降、不思飲食、嗜睡、豎毛、腹瀉、對外界刺激反應減弱等內毒素血癥表現，部分大鼠口鼻有紅色泡沫樣液體溢出。肺組織石蠟切片HE染色顯示:各膿毒癥組大鼠肺組織可見結構破壞，肺泡膨脹不全、肺泡融合或塌陷，肺泡腔內有滲出液;肺泡間

6、隔明顯增厚，可見大量炎性細胞浸潤;肺組織毛細血管擴張、淤血，管腔內充滿紅細胞，甚至有血栓形成，隨著膿毒癥炎癥損傷時間的延長，肺組織損傷程度不斷加重。
　　2.膿毒癥大鼠肺組織miR-30e、炎癥因子改變，及兩者之間的相關性。各膿毒癥組大鼠肺組織miR-30e表達水平相比正常對照組均明顯下調，且具有明顯統(tǒng)計學差異(P＜0.01)，其中模型組24h下調最明顯;膿毒癥組3h、6h、12h、24h IL-1β、TNF-α相對表達水平與正常

7、對照組相比均顯著上升(P＜0.01)，且在膿毒癥3h時達到最高峰，隨后開始下降，但與正常對照組相比仍然明顯上調且有統(tǒng)計學意義。各實驗組大鼠肺組織中miR-30e與IL-1β水平呈負相關性(r=-0.417，P=0.022)，與TNF-α水平也呈負相關性(r=-0.437，P=0.016)。
　　3.LPS刺激NR8383細胞后不同時間點細胞中miR-30e、炎癥因子的表達改變，及兩者之間的相關性。LPS刺激3、6、12、24小時后

8、miR-30e表達水平相比空白對照組均明顯下調，且具有明顯統(tǒng)計學差異(P＜0.01)。其中LPS3h組下調最明顯;LPS刺激3、6、12、24小時后IL-1β、TNF-α相對表達水平相比空白對照組均顯著上升(P＜0.01)，且同膿毒癥大鼠肺組織結果一致，在LPS3h組時達到最高峰，隨后開始下降，但與空白對照組相比仍然明顯上調且有統(tǒng)計學意義。LPS刺激NR8383細胞后不同時間點細胞中miR-30e的表達水平與IL-1β水平呈負相關性（r

9、=-0.713，P=0.003），與TNF-α水平也呈明顯負相關性(r=-0.712，P=0.002)。
　　4.miR-30e靶基因的預測及驗證。生物信息學預測結果顯示，miR-30e5'端種子區(qū)與Notch1 mRNA3'UTR區(qū)互補結合，提示Notch1基因很可能是miR-30e作用的靶基因，為后續(xù)的實驗提供了理論基礎。LPS刺激NR8383細胞6、12、24小時后細胞中Notch1蛋白含量灰度值均較LPS0h、LPS3h組

10、明顯上調，隨著刺激時間的延長，Notch1蛋白表達逐漸增加，且均具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)，LPS+miR-30e m組較LPS+NC m組Notch1蛋白的表達水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(t=33.767，P＜0.01);LPS+miR-30e i組較LPS+NC i組Notch1蛋白的表達水平明顯升高，差異亦有統(tǒng)計學意義(t=-11.371，P＜0.01)，表明Notch1蛋白表達受到miR-30e的調控。
　　5.m

11、iR-30e對LPS誘導肺泡巨噬細胞NR8383炎癥反應發(fā)揮的作用。LPS+miR-30e m組較LPS+NC m組TNF-α、IL-1β的mRNA表達水平明顯降低(TNF-α:t=19.574，P＜0.01; IL-1β: t=3.477，P=0.025);與LPS+NC i組相比較，LPS+miR-30e i組TNF-α、IL-1β的mRNA表達水平明顯升高(TNF-α:t=-6.606,P＜0.01; IL-1β: t=-3.45

12、7，P=0.026)。LPS+miR-30e m組較LPS+NC m組的TNF-α、IL-1β的蛋白表達水平明顯降低(TNF-α:t=5.899，P=0.004;IL-1β: t=5.107，P=0.007);而與LPS+NC i組相比較，LPS+miR-30e i組TNF-α、IL-1β的蛋白表達水平明顯升高，差異亦有統(tǒng)計學意義(TNF-α:t=-6.785，P=0.002; IL-1β: t=-3.662, P=0.022)。