PTEN磷酸化修飾在HMGB1誘導(dǎo)的小鼠系膜細(xì)胞增殖中的作用及其調(diào)控機(jī)制.pdf

1、目的：探討PTEN的磷酸化修飾是否參與HMGB1誘導(dǎo)的小鼠系膜細(xì)胞增殖及其磷酸化修飾的調(diào)控機(jī)制。
　　方法：
　　1以小鼠系膜細(xì)胞（mouse mesangial cell, MMC）為研究對(duì)象，100μg.L-1HMGB1為刺激物，分別于刺激0 h、12 h和24 h收集細(xì)胞，Western blot技術(shù)檢測(cè)PCNA蛋白表達(dá)變化；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)BrdU陽(yáng)性細(xì)胞百分率。
　　2以100μg.L-1HMGB1刺激MMC，

2、分別于刺激0 min、10 min、30 min、60 min和120 min時(shí)收集細(xì)胞，Western blot技術(shù)檢測(cè)p-PTEN-Ser380、p-PTEN-Ser370、p-S6K-Thr389、S6K蛋白表達(dá)。
　　3將常規(guī)培養(yǎng)的 MMC隨機(jī)分為對(duì)照組（control group）、HMGB1刺激組（ HMGB1 group）、HMGB1+空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（ H+EV）、HMGB1+PTEN非磷酸化質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（H+S380

3、A）和HMGB1+PTEN持續(xù)磷酸化質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（H+S380D），以 BrdU摻入結(jié)合免疫熒光技術(shù)檢測(cè)BrdU表達(dá)；免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測(cè)Ki67蛋白的表達(dá)。
　　4將常規(guī)培養(yǎng)的 MMC隨機(jī)分為 control group、HMGB1 group和HMGB1+PF-4708671 group,先加入25μmol.L-1的PF-4708671預(yù)處理24 h,再更換為含100μg.L-1HMGB1的培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育10min、30min

4、和24 h， Western blot技術(shù)檢測(cè)p-PTEN-Ser380、p-S6K-Thr389、S6K和PCNA蛋白的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　1 HMGB1能夠上調(diào)小鼠系膜細(xì)胞的增殖水平
　　1.1流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示：與HMGB1刺激0 h組相比，HMGB1刺激12 h組 BrdU陽(yáng)性細(xì)胞百分率有所升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而HMGB1刺激24 h時(shí)，其陽(yáng)性細(xì)胞百分率明顯增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.0

5、5）。
　　1.2 Western blot結(jié)果顯示：與HMGB1刺激0 h組相比，HMGB1刺激12 h組與HMGB1刺激24 h組PCNA蛋白表達(dá)明顯升高，并且HMGB1刺激24 h時(shí)PCNA蛋白表達(dá)高于HMGB1刺激12 h時(shí)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　2 HMGB1誘導(dǎo)小鼠系膜細(xì)胞中 PTEN(Ser380)發(fā)生磷酸化修飾（p-PTEN-Ser380）
　　Western blot結(jié)果顯示：H

6、MGB1刺激10 min時(shí)p-PTEN-Ser380水平升高，30 min達(dá)高峰，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；隨后降低，120 min時(shí)回落至正常水平；而 HMGB1刺激各時(shí)間點(diǎn)， PTEN(Ser370)的磷酸化水平（p-PTEN-Ser370）均無(wú)明顯變化。
　　3 PTEN(Ser380)的磷酸化參與HMGB1誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞增殖
　　BrdU摻入法細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，HMGB1

7、刺激組BrdU陽(yáng)性細(xì)胞百分率明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與HMGB1刺激組相比，HMGB1+空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組BrdU陽(yáng)性細(xì)胞百分率無(wú)明顯變化，HMGB1+PTEN非磷酸化質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組BrdU陽(yáng)性細(xì)胞百分率明顯下降，HMGB1+PTEN持續(xù)磷酸化質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組BrdU陽(yáng)性細(xì)胞百分率明顯升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示：Ki67陽(yáng)性信號(hào)主要定位于細(xì)胞核，與對(duì)照組相比，HMGB1刺激組

8、Ki67陽(yáng)性細(xì)胞百分率明顯上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與HMGB1刺激組相比，HMGB1+空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組Ki67陽(yáng)性細(xì)胞百分率無(wú)明顯變化，HMGB1+PTEN非磷酸化質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組Ki67陽(yáng)性細(xì)胞百分率明顯下降，而HMGB1+PTEN持續(xù)磷酸化質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組Ki67陽(yáng)性細(xì)胞百分率明顯上調(diào)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。4 HMGB1促進(jìn)小鼠系膜細(xì)胞中S6K(Thr389)發(fā)生磷酸化
　　Western blot結(jié)果顯

9、示：與HMGB1刺激0 min組相比，HMGB1刺激10 min后S6K(Thr389)磷酸化水平(p-S6K-Thr389)升高，30 min時(shí)有所回落，但仍高于正常對(duì)照組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），60 min和120 min接近正常水平；HMGB1刺激各時(shí)間點(diǎn)，總S6K表達(dá)無(wú)明顯變化。
　　5 PF-4708671能夠抑制HMGB1誘導(dǎo)的小鼠系膜細(xì)胞中p-PTEN-Ser380、PCNA、p-S6K-Thr389

10、蛋白的表達(dá)
　　Western blot結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比， HMGB1刺激組中p-PTEN-Ser380、p-S6K-Thr389和 PCNA蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)；而與HMGB1刺激組相比， HMGB1+PF-4708671組 p-PTEN-Ser380、p-S6K-Thr389和PCNA蛋白表達(dá)水平明顯下降，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1 HMGB1能夠促進(jìn)小鼠系膜細(xì)胞中PTEN(S