大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后ERK、MMP-9、IL-6的表達與損傷時間的相關(guān)性研究.pdf

1、背景和目的：
　　創(chuàng)傷性腦損傷（Traumatic brain injury，TBI）是臨床神經(jīng)腦外科最常見的急、危、重癥狀之一。TBI在暴力性死亡中占首要位置。其程度從輕度腦震蕩、輕度TBI到重度TBI不等。TBI占全身外傷發(fā)生率的第二位、死亡率的第一位，已成為45歲以下人群最重要的致殘因素。在所有疾病當中，TBI具有最廣泛、最多變的癥狀和結(jié)果。目前臨床上尚缺乏慢性神經(jīng)病理和神經(jīng)行為以及 TBI關(guān)聯(lián)的早期神經(jīng)病理學(xué)的相關(guān)治療方案

2、。目前TBI后經(jīng)常出現(xiàn)嚴重的炎癥及炎癥反應(yīng)，為了改善 TBI結(jié)果，深入了解其機制。目前很多基礎(chǔ)和臨床研究者正在深入研究相關(guān)的動物模型以及臨床個體一期、二期臨床試驗。
　　在司法鑒定機構(gòu)中，TBI也是法醫(yī)師常見鑒定內(nèi)容之一。TBI的發(fā)生備受世界各國醫(yī)學(xué)研究者的廣泛關(guān)注，已成為世界性主要健康問題。中度腦損傷占顱腦損傷年發(fā)病率的22％，通常會使患者有持續(xù)性缺陷。輕度腦損傷在人群中發(fā)病率最高，占總傷害的75%，甚至有可能高于流行病學(xué)統(tǒng)計報

3、告，因為年輕人、運功員和軍人的報告數(shù)量嚴重不足。總的來說，受社會經(jīng)濟收入因素的影響，TBI仍然是年齡在45歲以下的成年人最常見的死亡原因，也是造成長期殘疾的最大原因。隨著人口老齡化，我們也看到老年人口的相對發(fā)病率上升。隨著對普通人群及軍隊特殊人群TBI意識的提高，TBI不再是一個沉默的話題。TBI既是急性障礙，也是一些患者的慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病。然而，這種認識也揭示了科學(xué)文獻中的許多問題需要進一步澄清，因為它引出了很多問題。
　　TB

4、I是由原發(fā)的損傷、繼發(fā)的損傷兩種損傷形式共同作用的一種十分復(fù)雜的疾病。繼發(fā)的損傷是在原發(fā)損傷后出現(xiàn)的一種加重機體損害的情況。許多促進凋亡的誘導(dǎo)因子激活信號傳導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)，致使相關(guān)蛋白磷酸化，促進凋亡程序，導(dǎo)致細胞凋亡，進而使病情惡化，在一定程度上嚴重影響了病人治療和預(yù)后。研究已證實，繼發(fā)損傷具有一定的延遲性，這給臨床治療方面提供了一定緩沖的時間。TBI后造成的腦水腫、腦出血、炎癥等各種應(yīng)激反應(yīng)離不開信號通路、特異性蛋白與炎性因子的參與。在

5、腦神經(jīng)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，ERK信號傳導(dǎo)通路是中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展過程中重要傳導(dǎo)途徑之一，在腦缺血和腦創(chuàng)傷等神經(jīng)細胞的凋亡過程中起到重要作用。靜息狀態(tài)下，ERK位于胞漿，機體受到外界刺激后，ERK發(fā)生磷酸化，磷酸化的ERK是ERK的活性形式，參與調(diào)節(jié)細胞生長、細胞凋亡。ERK信號通路可能通過提高下游MMP-9、IL-6的表達進一步加重TBI后的繼發(fā)癥狀。為了驗證ERK、MMP-9、IL-6三者之間的相關(guān)性，我們通過本實驗制備 TBI動物

6、模型，并利用該模型觀察大鼠腦組織損傷后病理生理變化，檢測ERK、MMP-9、IL-6在TBI后不同時間段的表達，闡明三者在TBI后發(fā)生病理生理過程中的作用，研究其表達的時序性規(guī)律，為顱腦損傷時間的推斷提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　健康成年清潔級SD（Sprague Dawley，SD）成年大鼠80只，雌雄不限，體重290-350g，統(tǒng)一購自河南省實驗動物中心[許可證號：SCXK（豫）2015-0004]。適應(yīng)性喂養(yǎng)14天后

7、，隨機分為對照組（大鼠只數(shù)：10）和實驗組（大鼠只數(shù)：70）。實驗組參照Feeney自由落體打擊裝置制備大鼠腦損傷模型；對照組大鼠不做顱腦打擊，其他處理同實驗組。按照傷后1h、6h、12h、24h、48h、72h、7d這七個時間點順序，將對照組10只大鼠隨機均分為免疫組化組、熒光定量PCR組，分別檢測ERK、MMP-9、IL-6陽性細胞表達率和ERK mRNA、MMP-9 mRNA、IL-6 mRNA的相對表達量。①免疫組化組：心臟灌流

8、后用4%多聚甲醛進行固定，斷頭取腦，制作石蠟切片，然后進行常規(guī)HE染色。觀察大鼠腦皮質(zhì)及海馬形態(tài)學(xué)改變，并用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測ERK、MMP-9、IL-6陽性表達。②熒光定量PCR組：于建模后對應(yīng)時間點斷頭處死大鼠，無菌條件操作，立即取出全腦，以損傷灶為中心剪取傷側(cè)腦組織約50g，標記編號，放于凍存管，置于液氮罐保存。按照實驗計劃提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，通過熒光定量PCR檢測ERK mRNA、MMP-9 mRNA及IL-6 m

9、RNA的相對表達量。
　　結(jié)果：
　　1.大鼠TBI后相關(guān)行為學(xué)觀察結(jié)果：實驗中，1只大鼠因顱腦受打擊后出血過多而死亡；其余大鼠在顱腦受打擊瞬間打擊部位立即出血，四肢出現(xiàn)不同程度的短暫抽搐。精神模糊，并且各種反射暫時消失等現(xiàn)象。觀察腦組織標本發(fā)現(xiàn)，大鼠顱腦損傷處有硬腦膜下腔血腫現(xiàn)象。
　　2.大鼠TBI后神經(jīng)功能評分結(jié)果：參考Arrieta Cruz等、Ziporen等兩組實驗團隊制定的評分量表，對相應(yīng)組大鼠進行顱腦損

10、傷后1h評估，結(jié)果 P<0.05。
　　3.大鼠腦組織皮質(zhì)和海馬HE常規(guī)染色結(jié)果：組織間隙變大，神經(jīng)元胞體之間結(jié)構(gòu)不清。
　　4.大鼠TBI后，實驗組p-ERK1h增高，6h-12h持續(xù)升高，24h-48h高表達，48h下降，7d時，p-ERK表達仍高于對照組
　　5.大鼠TBI后，實驗組MMP-1h時增高，1h-24h呈現(xiàn)持續(xù)增加狀態(tài)，24h-72h高表達，7d表達仍高于對照組。
　　6.大鼠TBI后炎性因子I