大鼠BMSCs保護(hù)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：探討大鼠BMSCs體內(nèi)、外保護(hù)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞的情況。
　　 方法：從SD大鼠骨髓中提取MSCs，經(jīng)體外擴(kuò)增、純化并進(jìn)行鑒定。體外實(shí)驗(yàn)，采用3周齡左右的雌性SD大鼠，皮下注射60單位的孕馬血清，48小時(shí)后無(wú)菌條件下取出雙側(cè)卵巢，用皮試針針頭在體視鏡下刺破各卵泡，沖出顆粒細(xì)胞。顆粒細(xì)胞在體外擴(kuò)增、純化并進(jìn)行鑒定。用MTT法得出順鉑對(duì)顆粒細(xì)胞的半抑制濃度及最佳干預(yù)時(shí)間。采用半抑制濃度的30％即5mg/l作為實(shí)驗(yàn)的干預(yù)濃度，干預(yù)

2、時(shí)間為72h。體外實(shí)驗(yàn)分為：G0組 顆粒細(xì)胞；G5組 顆粒細(xì)胞+5mg/l順鉑；GM5組 顆粒細(xì)胞+5mg/l順鉑+BMSCs. GM5組采用Millicell 共培養(yǎng)小室把顆粒細(xì)胞和BMSCs分上下兩層進(jìn)行共培養(yǎng)，BMSCs分泌的細(xì)胞因子可以自由通過(guò)。實(shí)驗(yàn)各組干預(yù)72h后，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組顆粒細(xì)胞的凋亡率，RT-PCR技術(shù)檢測(cè)各組顆粒細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)情況。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)分為四組：空白組、MSCs組、雌激素組、青年組。前三組采用9

3、～10月齡的SD雌性大鼠各15只，青年組采用15只3～4月齡的SD雌性大鼠。通過(guò)陰道脫離細(xì)胞監(jiān)測(cè)前三組圍絕經(jīng)模型鼠進(jìn)入圍絕經(jīng)后，空白組通過(guò)尾靜脈輸注2ml的生理鹽水，一周后重復(fù)注射等量生理鹽水；MSCs組經(jīng)尾靜脈輸注2ml含1～2′106MSCs，一周后注射相同劑量細(xì)胞懸液；雌激素組灌用生理鹽水溶解的尼爾雌醇，按0.158mg/(kg.d)灌胃給藥，連續(xù)給藥8w；青年組采用3月齡左右的SD大鼠經(jīng)尾靜脈注射2ml的生理鹽水，一周后重復(fù)注射

4、等量生理鹽水。實(shí)驗(yàn)各組干預(yù)后第一、三個(gè)月，分別處死各組SD大鼠，取左側(cè)卵巢經(jīng)固定、切片做TUNEL凋亡染色，在顯微鏡下統(tǒng)計(jì)顆粒細(xì)胞的凋亡率。
　　 結(jié)果：體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：G0、G5、GM5各組凋亡率分別為0.59％、13.04％、4.84％。凋亡相關(guān)基因表達(dá)情況分別為：Survivn GO>GM5>G5；P21G5>GO>GM5；Cmy-c G0>GM5>G5；Bax G5>GO>GM5；Bcl-2 G0>GM5>G5。體內(nèi)實(shí)

5、驗(yàn)結(jié)果顯示在干預(yù)一個(gè)月后實(shí)驗(yàn)各組卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡率分別為：空白組9.90±3.23％、MSC組6.10±2.63％（P=0.075）、雌激素組6.60±3.13％（P=0.139）、青年組1.53±1.44％（P=0.001）；干預(yù)三個(gè)月后實(shí)驗(yàn)各組卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡率分別為：空白組14.60±3.51％、BMSC組8.29±3.35％（P=0.02）、雌激素組10.53±2.29％（P=0.062）、青年組3.56±1.44％（P<0