水稻螟蟲嗅覺相關蛋白基因的克隆、表達及功能分析.pdf

1、二化螟Chilo suppressalis(Walker)，屬鱗翅目螟蛾科，是我國水稻上一種重要的害蟲。昆蟲嗅覺在感受氣味物質、尋找寄主、交配等方面起著重要的作用。在對二化螟觸角感器有一定了解的基礎上，有必要對其嗅覺識別的分子機制進行研究，闡明嗅覺反應的本質原因，找到新的作用靶標，為篩選、研究安全高效的引誘劑、趨避劑等提供幫助；同時昆蟲作為良好的模式生物，對其嗅覺的研究能夠有助于深入研究人類嗅覺的本質。本研究通過RT-PCR、RACE克

2、隆得到了嗅覺相關的蛋白基因，原核系統(tǒng)表達純化了蛋白、并對蛋白的功能進行了研究。獲得的主要結果如下： 1.利用RT-PCR和RACE方法得到了鱗翅目螟蛾科昆蟲二化螟gobp2全長基因。該基因最大編碼框為489個核苷酸，編碼162個氨基酸殘基，預測的分子量為18.192kDa，等電點為5.08，前21個編碼氨基酸為信號肽序列，具有氣味結合蛋白的典型特征。成功構建了CsupGOBP2的原核表達載體pET30a/CsupGOBP2，并在

3、大腸桿菌中成功表達，經(jīng)過親和層析和凝膠過濾獲得高純度的蛋白，免疫家兔制備了多克隆抗體。通過RT-PCR和Western blot方法對二化螟gobp2基因在mRNA水平和蛋白水平的表達譜進行了分析，結果表明GOBP2在二化螟雌雄蟲觸角中都表達且表達量相同。 以(N-pheny1-1-naphthylamine)1-NPN為熒光探針，利用熒光結合實驗方法對純化蛋白的功能進行了分析，結果表明1-NPN結合在蛋白結構的內部，來自水稻揮

4、發(fā)物和性信息素成分的各種氣味分子對1-NPN/GOBP2復合物中的1-NPN有不同的競爭能力，cis-11-hexadecenal和Laurinaldehyd兩種醛類物質對1-NPN競爭能力最強，表明在所檢測的17種物質中這兩種物質對GOBP2結合能力最強。 2.應用Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)中在昆蟲細胞Tn中表達了二化螟GOBP2蛋白，用His-Tag單抗及兔多克隆抗體進行Western blot分析結果證實表達的蛋

5、白為His與GOBP2的融合蛋白。 3.克隆了大螟、稻縱卷葉螟gobp2基因部分cDNA序列，對CsupGOBP2、SinfGOBP2、CmedGOBP2的序列分析結果表明該基因在一定程度上反映了鱗翅目昆蟲親緣關系的遠近，與形態(tài)上的分科結果是一致的。 4.利用RT-PCR和RACE技術克隆了二化螟gobpl基因全長序列，該基因最大編碼框為522個核苷酸，編碼173個氨基酸殘基，預測的分子量為20.039kDa，等電點為4

6、.84。推斷的信號肽為前22個氨基酸。對3'末端的擴增首次發(fā)現(xiàn)該基因的3'UTR可能存在長度不同的轉錄本；成功構建了該基因的原核表達載體pET30a/CsupGOBP1，制備了兔多克隆抗體，利用熒光結合實驗對該蛋白對不同氣味分子的檢測結果表明所檢測的氣味分子對熒光探針1-NPN的競爭能力都很弱，說明對蛋白的結合能力較弱。 5.利用RT-PCR和RACE方法成功克隆了二化螟pbp2基因全長cDNA序列，并對基因組序列進行了擴增。該

7、基因最大編碼框為498個核苷酸，編碼165個氨基酸殘基，預測的分子量為18.554 kDa，等電點為4.71。PBP2序列片段經(jīng)Signal3.0分析表明該蛋白推斷的信號肽及最大可能的切割位點為前21個氨基酸。 對pbp2基因組的分析表明該基因具有相同的3個外顯子-2個內含子結構，僅在長度上存在較大差異。外顯子1和外顯子2在昆蟲PBP基因進化中大小一致，而外顯子3則變異較大。同時內含子的插入位點在該基因中也是很保守的，第1、2個

8、內含子分別在編碼蛋白的Glu22、Ala82(Ala81)位氨基酸之后插入，但插入的內含子的長度變異較大(76bp-437 bp、104 bp-1251 bp)。 構建了pET30a/CsupPBP2原核表達載體，割膠回收的蛋白免疫家兔制備了多克隆抗體，對純化的蛋白利用內源熒光的變化對二化螟三種信息素成分Z11-16:Ald、Z9:16:Ald、Z13-18:Ald的測定結果表明Z11-16:Ald對蛋白內源熒光有明顯的淬滅作用

9、，而Z9:16:Ald、Z13-18:Ald對熒光的淬滅作用不大。 6.通過已報道的其它昆蟲的基因序列信息設計兼并引物擴增了二化螟、大螟的OR受體基因，結果表明二化螟、大螟中有該受體基因的表達，與鱗翅目其它種昆蟲序列相似性很高，在整個昆蟲種群中高度保守。在原核系統(tǒng)中的表達沒有成功。 7.構建了二化螟觸角cDNA文庫，酶切鑒定及通過PCR方法從文庫中篩選CsupGOBP1、CsupGPBP2、CsupPBP2基因的結果顯示