油菜S45AB隱性核不育分子機(jī)理與應(yīng)用研究.pdf

1、油菜是我國主要的油料作物,雜種優(yōu)勢利用是提高油菜產(chǎn)量、品質(zhì)和抗性的有效途徑,而雄性不育是油菜雜種優(yōu)勢利用的最主要途徑。油菜隱性細(xì)胞核雄性不育因其具有不育性徹底穩(wěn)定、細(xì)胞質(zhì)來源豐富、恢復(fù)源廣等優(yōu)點(diǎn),已經(jīng)成為國內(nèi)雜種優(yōu)勢利用的一條重要途徑,但是目前對隱性核不育機(jī)理的研究卻比較滯后。隱性核不育系S45A來源于四川大學(xué),由潘濤等(1988)在甘藍(lán)型油菜品種Oro中發(fā)現(xiàn)的自然突變體衍生而來,經(jīng)過多代的兄妹交保存,遺傳分析證明S45A的不育性受兩對

2、重疊隱性基因控制,但是在雜交制種時(shí)需人工拔除母本行中50％的可育株,限制了其廣泛應(yīng)用?；谝陨?本研究開展了以下兩個(gè)方向的工作:以S45AB作為基礎(chǔ)材料,利用細(xì)胞學(xué)和分子生物學(xué)的方法,闡述了該核不育系的分子機(jī)理,另一方面利用轉(zhuǎn)基因的方法對創(chuàng)建此種核不育系的保持系進(jìn)行了初步研究。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.甘藍(lán)型油菜S45AB隱性核不育的分子機(jī)理研究1.1掃描電鏡(SEM)觀察花粉粒和花藥的形態(tài),結(jié)果表明可育材料S45B形成的花

3、粉粒比較飽滿,花粉外壁有復(fù)雜的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。而不育材料S45A的花粉粒癟小,破裂,花粉外壁平滑；花藥的觀察,S45A的花藥比S45B要短,S45B的花藥表皮有線狀或者盤狀的脂質(zhì)層,而S45A花藥表皮較為光滑,看不見脂質(zhì)晶體。
　　 1.2透射電鏡(TEM)觀察發(fā)現(xiàn)可育花藥和不育花藥在小孢子母細(xì)胞時(shí)期沒有明顯差異。不育材料,在四分體時(shí)期花粉外壁的發(fā)育出現(xiàn)異常,表現(xiàn)為外壁基柱不能正常形成或者伸長。隨后,在不育材料中小孢子沒有形成正常的花

4、粉外壁,小孢子的發(fā)育停留在單核期并最終解體。不育花藥的絨氈層與可育花藥相比,從單核期開始脂類物質(zhì)的積累減少,同時(shí)絨氈層液泡化和肥大明顯。以上研究表明,S45A花藥發(fā)育的異常最早發(fā)生在四分體時(shí)期,敗育主要是由于孢粉素合成的缺失和花粉外壁不能正常形成,絨氈層發(fā)育和脂類物質(zhì)沉積的異常。對于花藥表皮的觀察表明在第一次有絲分裂后,可育花藥表皮有豐富的脂類物質(zhì)的沉積,而不育花藥表皮的脂質(zhì)沉積較少。
　　 1.3與TEM觀察到的絨氈層細(xì)胞不正

5、常的肥大一致,TUNEL(for terminaldeoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling)分析的結(jié)果表明,S45A突變體絨氈層降解的異常是由不育花藥絨氈層的PCD(programmed cell death)受阻所致。
　　 1.4前人通過精細(xì)定位將BnMs1基因和BnMs2基因鎖定在擬南芥第一染色體的同一區(qū)段,包括三個(gè)候選基因,其中有兩個(gè)基因可能

6、與花粉發(fā)育相關(guān),通過互補(bǔ)實(shí)驗(yàn),確定了來自于植物細(xì)胞色素(cytochrome P450,CYP450)P450基因家族的候選基因BnCYP70481能夠恢復(fù)S45A的育性,是隱性核不育系S45A的恢復(fù)基因。
　　 1.5通過RT-PCR,mRNA原位雜交表明,BnCYP704B1基因在雄蕊中表達(dá),并且是在絨氈層中特異表達(dá)。其表達(dá)起始于小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂時(shí)期,在四分體和單核期達(dá)最大,以后逐漸減弱至終止。啟動子-GUS分析表明,B

7、nCYP704B1是一個(gè)絨氈層特異表達(dá)的基因,其表達(dá)產(chǎn)物是小孢子發(fā)育所必需的。
　　 1.6分別對可育花藥和不育花藥表皮蠟質(zhì)和角質(zhì)的含量進(jìn)行了測定,結(jié)果表明單位重量的不育花藥表皮蠟質(zhì)含量與可育花藥相比沒有明顯變化,而角質(zhì)含量卻顯著減少。
　　 1.7對BnCYP704B1基因編碼的蛋白質(zhì)序列在NCBI上檢索與之同源來自不同物種的蛋白質(zhì)序列表明,BnCYP70481與擬南芥的CYP70481和水稻的CYP70482同源性較

8、高,目前的報(bào)道顯示CYP70481和CYP70482均催化中長鏈脂肪酸的ω-羥基化。據(jù)此推測,BnCYP70481基因可能編碼脂肪酸羥基化的酶,參與花粉外壁的合成。
　　 1.819份油菜材料的比較測序結(jié)果顯示對于Bncyp704B1-1基因,兩個(gè)錯(cuò)義突變中第一個(gè)突變位點(diǎn)是不育材料中特異的,是導(dǎo)致Bncyp70481-1功能失活,S45A敗育的因?yàn)椤?br>　　 1.9對BnCYP704B1亞細(xì)胞定位的結(jié)果表明該蛋白定位在內(nèi)質(zhì)

9、網(wǎng)中,可能參與了脂肪酸的羥基化。
　　 1.10對不育材料和可育材料各個(gè)時(shí)期的花蕾總脂類的測定結(jié)果表明,不育花蕾總脂肪酸的含量與可育花蕾相比極顯著減少,進(jìn)一步的確定了BnCYP70481基因參與了絨氈層中脂類的代謝。
　　 通過以上問題的研究,可以對兩對重疊基因控制的隱性核不育材料S45A的敗育機(jī)理做出揭示:我室成功分離的恢復(fù)基因BnCYP704B1參與了油菜花藥發(fā)育過程中花藥表皮角質(zhì)和花粉外壁孢粉素物質(zhì)的合成。BnCY

10、P70481功能的缺失導(dǎo)致了絨氈層不正常的脂類代謝和PCD的受阻,使得小孢子的發(fā)育受到嚴(yán)重的影響,從而導(dǎo)致完全的雄性不育和花藥表皮發(fā)育的異常。
　　 2.利用BnCYP704B1基因創(chuàng)建隱性核不育保持系的初步研究2.1構(gòu)建了兩個(gè)用于創(chuàng)建保持系的載體:載體一是利用化學(xué)誘導(dǎo)性的啟動子誘導(dǎo)致死基因在苗期表達(dá),用于生產(chǎn)不育系；載體二是采用化學(xué)誘導(dǎo)性的啟動子替換掉恢復(fù)基因BnCYP70481原有的啟動子,從而實(shí)現(xiàn)不育系的繁殖。