脂蛋白信號(hào)肽對(duì)纖維堆囊菌So0157-2木聚糖酶Xyn11B定位的影響.pdf

1、纖維堆囊菌S.cellulosum So0157-2能夠在以濾紙或木聚糖為唯一碳源的無(wú)機(jī)鹽平板上生長(zhǎng)。由于纖維素和半纖維素的異質(zhì)性和復(fù)雜性，它們的降解需要多種酶的協(xié)同作用，這說(shuō)明纖維堆囊菌S.cellulosum So0157-2中含有豐富的纖維素和半纖維素降解酶系能夠用來(lái)降解利用纖維素和半纖維素資源。
　　纖維堆囊菌對(duì)不可溶性多糖底物的利用呈現(xiàn)接觸性降解的特征。纖維素酶和木聚糖酶活力測(cè)定分析表明酶活力主要與細(xì)胞相關(guān)，而胞外組分活

2、力極低。因此推測(cè)相關(guān)酶類主要與細(xì)胞相結(jié)合。已測(cè)序的So0157-2基因組分析發(fā)現(xiàn):①基因組中很多多糖降解酶相關(guān)基因不具有引導(dǎo)目的蛋白分泌到細(xì)胞外的Ⅰ-型信號(hào)肽，這與胞外酶活力極低現(xiàn)象吻合。表明其多糖降解酶類主要不是以分泌到細(xì)胞外的游離形式而發(fā)生協(xié)同作用。②相對(duì)于接觸性降解的特征而言，So0157-2其基因組中也不含有纖維小體腳手架蛋白、粘附域、錨定域的同源基因序列，暗示著不存在纖維小體結(jié)構(gòu)。因此，基因組信息顯示纖維堆囊菌So0157-2

3、降解不溶性多糖的策略既不是胞外游離酶組分的協(xié)同作用方式，也不是纖維小體的高效復(fù)合體方式，可能采用與兩種經(jīng)典的微生物纖維素降解策略所不同的方式實(shí)現(xiàn)其對(duì)多糖底物的降解。
　　實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)So0157-2木聚糖酶Xyn11B的分析發(fā)現(xiàn)其具有脂蛋白信號(hào)肽、多聚絲氨酸區(qū)域及糖苷水解酶11家族催化域。因?yàn)槠淝皟蓚€(gè)特征在目前研究過(guò)的多糖降解酶類中較為罕見(jiàn)而成為實(shí)驗(yàn)室研究關(guān)注的目標(biāo)。對(duì)Xyn11B催化域的活性表達(dá)證明該酶組分在原始菌株纖維堆囊菌S

4、o0157-2中必然具有相應(yīng)的生理功能。Xyn11B酶學(xué)性質(zhì)研究中發(fā)現(xiàn)其對(duì)木聚糖水解產(chǎn)物只有木二糖的外切木聚糖酶特質(zhì)，也是GH11家族內(nèi)切木聚糖酶中未見(jiàn)報(bào)道過(guò)的。So0157-2木聚糖的酶Xyn11B脂蛋白信號(hào)肽及分揀序列特征引導(dǎo)的細(xì)胞定位與其底物降解特性和生理功能密切相關(guān)，也是解析其降解策略的基礎(chǔ)之一。脂蛋白信號(hào)肽能夠指引目的蛋白定位到內(nèi)膜或外膜上，具體位置與信號(hào)肽切割位點(diǎn)后的氨基酸序列相關(guān)。實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)纖維堆囊菌So0157-2的木

5、聚糖酶活力進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)有超過(guò)1/2的木聚糖酶活力位于膜組分中，說(shuō)明定位在膜上的木聚糖酶在木聚糖降解中發(fā)揮了重要的作用。本實(shí)驗(yàn)希望通過(guò)探究脂蛋白信號(hào)對(duì)木聚糖酶Xyn11B定位的影響，了解其脂蛋白信號(hào)肽及切點(diǎn)后的氨基酸序列對(duì)定位的影響規(guī)律，也會(huì)為推測(cè)纖維堆囊菌So0157-2的多糖降解方式提供一個(gè)證據(jù)。
　　本實(shí)驗(yàn)對(duì)纖維堆囊菌So0157-2木聚糖酶Xyn11B基因的N端脂蛋白信號(hào)肽及其切點(diǎn)后的氨基酸序列特征進(jìn)行了分析，+2到+5位

6、的氨基酸[DGGA]。對(duì)纖維堆囊菌So0157-2全基因組中的糖苷水解酶的生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)237個(gè)糖苷水解酶中有35個(gè)屬于脂蛋白，237個(gè)中有9個(gè)為木聚糖酶。GH11家族中所有細(xì)菌的木聚糖酶生物信息學(xué)預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)有19個(gè)屬于脂蛋白，其中有5個(gè)來(lái)源于纖維堆囊菌。
　　由于在本源菌中遺傳操作的局限性，我們選擇將木聚糖酶Xyn11B進(jìn)行異源表達(dá)，分別選取了與纖維堆囊菌親緣關(guān)系較近的黃色粘球菌DK1622和同為革蘭氏陰性菌蛋白異源表

7、達(dá)常用的大腸桿菌E.coli BL21(DE3)。設(shè)置了Xyn11B基因全長(zhǎng)和去掉脂蛋白信號(hào)肽的Xyn11 B-dlp兩個(gè)對(duì)照實(shí)驗(yàn)組。
　　在黃色粘球菌DK1622中，以pZJY41為表達(dá)載體，成功構(gòu)建了pZJY41-X11B和pZJY41-X11B-dlp兩個(gè)重組表達(dá)載體。利用anti-Flag單克隆抗體進(jìn)行的WesternBlot檢測(cè)，確定了木聚糖酶Xyn11B在粘球菌DK1622表達(dá)。組分分離得到胞外濃縮組分（100倍）、細(xì)

8、胞全破碎組分、胞內(nèi)組分和膜組分。在Western Blot檢測(cè)中，含pZJY41-X11B重組表達(dá)載體菌株檢測(cè)到的強(qiáng)陽(yáng)性信號(hào)在25kDa和33kDa處，分別為木聚糖酶Xyn11B催化域和去掉脂蛋白信號(hào)肽后表達(dá)產(chǎn)物，主要分布在胞內(nèi)組分中。含pZJY41-X11B-dlp重組表達(dá)載體菌株只在25kDa處檢測(cè)到陽(yáng)性信號(hào)，主要分布于胞內(nèi)組分。以上結(jié)果表明兩個(gè)表達(dá)載體(pZJY41-X11B和pZJY41-X11 B-dlp)，無(wú)論設(shè)計(jì)是含有脂蛋

9、白信號(hào)肽還是不含有，實(shí)際上表達(dá)出的蛋白已經(jīng)從N-端截短，所以脂蛋白信號(hào)肽是不發(fā)揮作用的，從而使目的蛋白滯留在胞內(nèi)。超薄切片制備過(guò)程中選取4％多聚甲醛-0.5％戊二醛進(jìn)行菌體固定使菌體結(jié)構(gòu)保存完好。免疫金標(biāo)記前用10％H2O2刻蝕10min，免疫金顆粒實(shí)現(xiàn)對(duì)菌體細(xì)胞的特異性標(biāo)記。免疫金標(biāo)記結(jié)果顯示含有pZJY41-X11B和pZJY41-X11B-dlp重組表達(dá)載體的兩株菌的金顆粒都特異性的分布于胞內(nèi)，與Western Blot檢測(cè)結(jié)果相

10、符合。將Western Blot與免疫金標(biāo)記結(jié)果相結(jié)合，目的蛋白不明原因的降解或者剪切致使目的蛋白滯留在胞內(nèi)，不能確定脂蛋白信號(hào)肽對(duì)木聚糖酶Xyn11B定位的影響。
　　隨后，將木聚糖酶Xyn11B在大腸桿菌BL21(DE3)進(jìn)行表達(dá)。以pET-22b為表達(dá)載體，成功構(gòu)建了pET-22b-X11B和pET-22b-X11 B-dlp兩個(gè)重組表達(dá)載體，獲得E.coli(22b)、E.coli(X11B)和E.coli(X11 B-d

11、lp)三個(gè)菌株。以樺木木聚糖為底物的活性檢測(cè)確定了目的蛋白的成功表達(dá)。通過(guò)組分細(xì)分得到了胞外濃縮組分、細(xì)胞全破碎、胞內(nèi)組分、周質(zhì)組分和膜組分。以β-半乳糖苷酶為胞內(nèi)標(biāo)志物，測(cè)定各組分中β-半乳糖苷酶的含量，說(shuō)明組分分離過(guò)程和方法合適，分離的組分可以用于相應(yīng)的后續(xù)檢測(cè)。對(duì)各組分進(jìn)行酶活測(cè)定，在E.coli(X11B)菌株中，有超過(guò)80％的木聚糖酶酶活力存在于膜組分中;在E.coli(X11B-dlp)菌株中，木聚糖酶酶活力在胞內(nèi)組分和周質(zhì)

12、組分中分布較高。Western Blot檢測(cè)中，E.coli(X11B)菌株檢測(cè)到的強(qiáng)陽(yáng)性信號(hào)在膜組分中;E.coli(X11B-dlp)菌株檢測(cè)到的強(qiáng)陽(yáng)性信號(hào)在胞內(nèi)和周質(zhì)組分中。而在免疫金標(biāo)記結(jié)果中，在E.coli(X11B)菌株中分布于胞內(nèi)，在膜上并沒(méi)有預(yù)期的特異性金顆粒分布，可能由于蛋白上的His標(biāo)簽被膜上的磷脂分子阻擋不能與抗體發(fā)生特異性反應(yīng)。在E.coli(X11B-dlp)菌株中，周質(zhì)組分雖有少量金顆粒存在，還不能確定為特異