纖維堆囊菌So9733-1木聚糖酶基因的克隆、表征與異源表達(dá)分析.pdf

1、本研究擬直接從基因水平出發(fā)，利用基因克隆、分析和表達(dá)等方法手段研究酶組分的相關(guān)性質(zhì)，以有效解決在酶學(xué)研究中遇到的阻力，為進(jìn)一步了解纖維堆囊菌纖維素酶組分的組織結(jié)構(gòu)方式和纖維素降解機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 首先對(duì)實(shí)驗(yàn)室分離得到的部分纖維堆囊菌菌株進(jìn)行了初步的纖維素酶酶活(CMC酶、葡萄糖苷酶、木聚糖酶等)測(cè)定分析，證明纖維素降解特性在實(shí)驗(yàn)室分離得到的纖維堆囊菌中普遍存在，但不同菌株表現(xiàn)出不同的纖維素降解能力，不同菌株中各種纖維素酶組分的活

2、力比例也存在差異。 根據(jù)上述結(jié)果和實(shí)驗(yàn)室前期工作基礎(chǔ)，選定纖維堆囊菌(S,cellulosum)菌株So9733-1作為纖維堆囊菌纖維素降解相關(guān)酶系研究的模式菌株，以酶活性普遍較高的木聚糖酶為分析靶標(biāo)，進(jìn)行So9733-1木聚糖酶基因的克隆、分析和表達(dá)研究。設(shè)計(jì)和收集了10條不同的引物對(duì)對(duì)So9733-1基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)片段純化、克隆和測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，GH10-F/GH10-R引物對(duì)擴(kuò)增出的一個(gè)長(zhǎng)度為422bp的片

3、段，經(jīng)BLAST比對(duì)分析顯示該片段為木聚糖酶基因片斷，屬于糖苷水解酶F/10家族。利用GH10-F/GH10-R引物對(duì)還在其他纖維堆囊菌菌株中獲得了不同長(zhǎng)度和氨基酸組成的木聚糖酶基因片斷，表明木聚糖酶基因在堆囊菌中的普遍存在性和多樣性。這一結(jié)果與酶活測(cè)定中顯示的結(jié)果較吻合。利用獲得的木聚糖酶氨基酸片斷與其他微生物來(lái)源的木聚糖酶片斷重建系統(tǒng)演化關(guān)系，結(jié)果表明來(lái)源于纖維堆囊菌的木聚糖酶片斷在Neighbor-joining系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)上處于相

4、對(duì)獨(dú)立的分支，可能屬于新型的木聚糖酶。 以試驗(yàn)篩選的合適的限制性內(nèi)切酶SalⅠ消化纖維堆囊菌So9733-1基因組DNA，以So9733-1中獲得的422bp木聚糖酶基因片段為探針，結(jié)合Southern雜交，建立了含有陽(yáng)性雜交片段的亞克隆文庫(kù)，經(jīng)對(duì)文庫(kù)克隆子的質(zhì)粒提取和斑點(diǎn)雜交逐級(jí)篩選，得到了4個(gè)陽(yáng)性克隆子，經(jīng)測(cè)序分析獲得了兩個(gè)完整的木聚糖酶基因，定名為xynA、xynB。生物信息學(xué)分析表明，xynA、xynB的開(kāi)放閱讀框(O

5、RF)大小分別為1302bp、1197bp，編碼433aa、398aa的多肽鏈。同GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析得知氨基酸序列相似性分別為60％、70％。 采用亞克隆技術(shù)，設(shè)計(jì)帶有NdeⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)的PCR引物分別擴(kuò)增出xynA和xynB兩個(gè)木聚糖酶基因的ORF區(qū)，以pET-22b(+)作為表達(dá)載體，NdeⅠ、XhoⅠ雙酶切后連接轉(zhuǎn)化受體菌E.coliBL21(DE3)中表達(dá)木聚糖酶基因，分別獲得了陽(yáng)性重組表達(dá)子BL-p

6、ET-xynA、BL-pET-xynB，分析表明BL-pET-xynA、BL-pET-xynB誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物均為包涵體形式，經(jīng)尿素梯度透析方法復(fù)性后，均具有木聚糖酶活性，其中BL-pET-xynA酶活性較低，不適合進(jìn)行后續(xù)酶學(xué)性質(zhì)分析，有待于進(jìn)行進(jìn)一步的研究。而對(duì)復(fù)性純化后的BL-pET-xynB表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行初步的酶學(xué)性質(zhì)分析表明，該木聚糖酶的Km值為1.2mg/ml，最適反應(yīng)溫度為45℃左右，最適pH為6.5左右。酶對(duì)溫度穩(wěn)定性較差，5