Sorangium cellulosum So0157-2木聚糖酶Xyn11B中特殊序列對其功能的影響.pdf

1、纖維堆囊菌（Sorangium cellulosum）可以在只含有結(jié)晶纖維素濾紙的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中生長，或者以木聚糖為唯一碳源培養(yǎng)基中生長。S.cellulosum So0157-2是本實(shí)驗(yàn)室分離得到的產(chǎn)埃博霉素的重要菌株，其基因組測序發(fā)現(xiàn)含有多個(gè)木聚糖降解酶編碼基因。
　　對S.cellulosum So0157-2基因組中木聚糖酶進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，其中的一個(gè)木聚糖酶Xyn11B除了具有糖苷水解酶11家族(GH11)保

2、守的催化域這一常規(guī)結(jié)構(gòu)域外，其他區(qū)域或者序列則具有特殊性，包括:N-端具有引導(dǎo)蛋白錨定于細(xì)胞內(nèi)膜或者外膜上的典型的脂蛋白信號肽（Ⅱ型信號肽），而不是常規(guī)的引導(dǎo)蛋白分泌于細(xì)胞外的I型信號肽;在信號肽與GH11催化域之間為一段不常見的、絲氨酸殘基數(shù)達(dá)到86％(51/58)的聚絲氨酸區(qū)(Polyserine linker，PSL);序列比對還顯示較常規(guī)GH11序列而言，催化域中有兩段明顯的插入序列;不具有一般內(nèi)切木聚糖酶中常見的底物結(jié)合區(qū)(C

3、BM)等。這些特殊性使Xyn11B在S.cellulosum So0157-2豐富的木聚糖酶中成為我們關(guān)注的重點(diǎn)，開展了深入的研究。
　　前期的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Xyn11B在大腸桿菌的多個(gè)載體中表達(dá)均發(fā)生降解，無法獲得目的蛋白，而只表達(dá)催化域時(shí)發(fā)現(xiàn)，不僅可以獲得目的蛋白，而且具有酶活。表明PSL的有無影響著蛋白的穩(wěn)定性。采取將PSL截短的方式來進(jìn)一步研究PSL的長度和序列對目的蛋白的影響。將Xyn11B的PSL進(jìn)行隨機(jī)截短，構(gòu)建了8個(gè)PS

4、L截短體，在pGEX-6P-1中表達(dá)，除S48和S61在用Ppase切除GST標(biāo)簽后，目的蛋白發(fā)生降解，無法獲得目的蛋白之外，其他截短體均可獲得不同穩(wěn)定程度目的蛋白。發(fā)現(xiàn)PSL保留越完整，目的蛋白越易于被降解，攜帶PSL越短，目的蛋白越穩(wěn)定。證明PSL的存在與否及其不同的長度影響著目的蛋白的穩(wěn)定性，并且發(fā)現(xiàn)PSL的存在可是木聚糖酶耐受酸性環(huán)境。目前尚無法建立序列特征與蛋白穩(wěn)定性之間的關(guān)系。通過分析PSL截短突變體的酶學(xué)性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)PSL的

5、存在可以使蛋白耐受強(qiáng)酸性。上述結(jié)果為進(jìn)一步分析該蛋白在原始菌株S.cellulosumSo0157-2中的存在形式、穩(wěn)定性調(diào)節(jié)和功能發(fā)揮奠定了基礎(chǔ)，為獲得可進(jìn)行研究和應(yīng)用的穩(wěn)定性蛋白提供了依據(jù)。
　　在構(gòu)建PSL截短體以及測定其酶學(xué)性質(zhì)時(shí)發(fā)現(xiàn)，位于催化域N-端的一段氨基酸序列，能夠顯著提高酶的最適作用溫度。D111的最適溫度為65℃，而Xyn11B-C(T131)的最適溫度為40℃，二者相差20個(gè)氨基酸，最適溫度相差25℃。影響最

6、適溫度的因素有很多，包括氫鍵、離子鍵、芳香環(huán)的疏水作用、二硫鍵等。通過分析Xyn11B的三維結(jié)構(gòu)圖發(fā)現(xiàn)，在Y123-T131之間存在縱橫交錯(cuò)的氫鍵網(wǎng)，無法準(zhǔn)確定位到某一個(gè)或者某幾個(gè)氨基酸;而在這段氨基酸序列上卻有三個(gè)酪氨酸殘基，分別為Y123，Y126，Y130，推測苯環(huán)之間的相互作用導(dǎo)致最適溫度顯著提高。采用定點(diǎn)突變的方法，進(jìn)一步確定了這段序列中Y126與催化域中W346之間在空間上鄰近而產(chǎn)生的相互作用（Y126與W346）對最適溫度

7、的提高具有顯著的影響。通過測定突變體的溫度耐受發(fā)現(xiàn)，Xyn11B-S、Y126A/Y130A能夠耐受高溫，在100℃處理60min之后仍存在酶活;而Y130A不能耐受高溫，在70℃處理20min后，酶活顯著降低;W346A突變體也不能耐受高溫，在60℃處理5min后酶活幾乎完全喪失，說明Y130、W346對于該蛋白的熱穩(wěn)定性具有重要的影響。Y123-T131之間的氨基酸序列顯著提高最適溫度的作用是否通用性我們選取了來自纖維堆囊菌So01

8、57-2的Xyn11C作為改造對象，其最適溫度為40℃，屬于中溫性的木聚糖酶。將Y123-T131之間的序列分別添加到成熟蛋白dlp-Xyn11C和催化域Xyn11C-C上。發(fā)現(xiàn)其最適溫度分別提高了6℃和8℃，說明無論將該序列直接添加到整個(gè)序列或者催化域上均能顯著提高其最適溫度。但是測定其溫度耐受時(shí)發(fā)現(xiàn)，仍不能耐受高溫。本論文采用序列刪除截短或定點(diǎn)突變的研究方法，結(jié)果證明芳香環(huán)間的相互作用在該蛋白最適溫度的提高方面發(fā)揮顯著作用。為酶的最

9、適溫度及耐熱性的改造，適應(yīng)相應(yīng)的應(yīng)用目標(biāo)提供一定的理論依據(jù)和思路。
　　前期的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，表達(dá)的Xyn11B催化域Xyn11B-C作用于樺木木聚糖時(shí)產(chǎn)物只有木二糖。對Xyn11B-C晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析時(shí)發(fā)現(xiàn)，同Trichoderma reeseiXylanase XYNII相比，Xyn11B催化域中的兩段插入序列在酶結(jié)構(gòu)的“拇指”附近成為loop，命名為loop1和loop2。因?yàn)镚H11木聚糖酶的“拇指”被認(rèn)為在催化反應(yīng)中起關(guān)鍵的作

10、用，所以推測這兩段loop是導(dǎo)致Xyn11B-C酶解木聚糖產(chǎn)物為木二糖的原因。前期實(shí)驗(yàn)將loop1縮短至四個(gè)GH11家族木聚糖酶共有氨基酸之后，酶活完全喪失，與產(chǎn)物為木二糖無關(guān);，本研究中將Xyn11B-C中l(wèi)oop2刪除，構(gòu)建缺失loop2的突變蛋白Xyn11B-S2，TLC進(jìn)行產(chǎn)物圖譜分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，其產(chǎn)物不再是木二糖，而為一系列低聚寡糖。表現(xiàn)出典型的內(nèi)切木聚糖酶的特征。該結(jié)果表明loop2的存在是Xyn11B產(chǎn)物為單一木二糖的原因。本