重組人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-Ⅰ聚乙二醇修飾及體內(nèi)外活性研究.pdf

1、目的:研究大腸桿菌可溶性表達(dá)的重組人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-I型N端缺失23個(gè)氨基酸后的突變體(△N23KGF-I,簡(jiǎn)稱△K23)的聚乙二醇修飾、純化工藝及其體內(nèi)外生物活性。
　　方法:(1)破菌,SP sepharose F.F純化,復(fù)性和Heparin sepharose F.F純化得到突變體純品;(2)用mPEG-馬來酰亞胺修飾截短重組人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-I(△K23)的游離巰基,然后胰蛋白酶酶切,采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù),獲得質(zhì)量肽圖。

2、對(duì)比單體及修飾后的蛋白還原質(zhì)量肽圖和非還原質(zhì)量肽圖,確定PEG的修飾位點(diǎn);(3)通過NBL-7細(xì)胞、大鼠五氟尿嘧啶腸粘膜損傷模型進(jìn)行體內(nèi)外生物活性評(píng)價(jià)。
　　結(jié)果:獲得的△K23單體的純度能達(dá)到95％,工藝穩(wěn)定;通過對(duì)修飾工藝的研究,得到了兩個(gè)不同的修飾產(chǎn)物:mPEG-Mal-△K23-40(縮寫:PEG-K23-40)、mPEG-Mal-△K23-102(縮寫:PEG-K23-102)。前者修飾在Cys40位,后者修飾在Cys1

3、02位,100mg級(jí)△K23樣品修飾后純度達(dá)到95%以上,而且修飾位點(diǎn)單一。經(jīng)體外的NBL-7的細(xì)胞測(cè)活,△K23和PEG-K23-40、PEG-K23-102的活性保留了以KGF-1國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品作為對(duì)照品的生物活性的98%,65%,30%。在大鼠的腸粘膜損傷修復(fù)實(shí)驗(yàn)中,△K23和PEG-K23-40相對(duì)于模型組有明顯的效果,PEG-K23-102的效果則不明顯。
　　結(jié)論:在非常規(guī)的PEG修飾條件下,首次成功的修飾了△N23KGF