三孢布拉氏霉菌中三孢酸的分離純化及其作用機(jī)制研究.pdf

1、三孢酸能夠促進(jìn)三孢布拉氏霉菌中β-胡蘿卜素的生物合成,而三孢酸是此發(fā)酵過(guò)程的副產(chǎn)物,可以從發(fā)酵液中提取,回加到發(fā)酵液中來(lái)增加β-胡蘿卜素產(chǎn)量,因此建立一條經(jīng)濟(jì)可行的從發(fā)酵液中提取分離三孢酸的工藝具有很大的經(jīng)濟(jì)意義,同時(shí)三孢酸促進(jìn)β-胡蘿卜素的作用機(jī)制尚不清楚,近年來(lái)研究其作用機(jī)制日益受到人們的關(guān)注。
　　 本文建立了HPLC法檢測(cè)三孢酸的含量,其色譜條件為:色譜柱是反相C18柱(250×4.6mm,5μm,DiamodsilTM

2、),檢測(cè)波長(zhǎng)是325nm,柱溫是30℃,流動(dòng)相是甲醇和含0.1％TFA的水,采用梯度洗脫方式,A泵為100％甲醇,B泵為0.1％TFA的超純水,甲醇從50％35min內(nèi)線性升為70％,進(jìn)樣量為10μl,流速1.0ml／min。HPLC方法比紫外分光光度法準(zhǔn)確度和精密度高,而且快捷、簡(jiǎn)便,檢測(cè)過(guò)程應(yīng)用梯度洗脫不僅縮短了分析時(shí)間,而且提高了分離效果。
　　 研究了液-液萃取法可以得到純度30％左右的三孢酸,若重復(fù)NaHCO3和氯仿的

3、萃取步驟,可以得到純度稍高的三孢酸,但是純度不超過(guò)40％。
　　 研究了Sephadex LH-20葡聚糖凝膠色譜分離三孢酸的最佳條件是:洗脫劑為40％甲醇水溶液,流速是2ml／min,由此可以得到純度是70％左右的三孢酸。
　　 研究了硅膠柱色譜分離三孢酸的條件是:流動(dòng)相氯仿:乙酸乙酯:石油醚:乙酸(v:v:v:v)=14:3:5:0.5,當(dāng)上樣量控制在100mg以內(nèi),三孢酸純度大于60％。
　　 研究了不同大

4、孔吸附樹(shù)脂對(duì)三孢酸的吸附和解吸特性,確定了SP850為最佳樹(shù)脂,優(yōu)化了吸附與解吸的工藝條件:發(fā)酵液中三孢酸的濃度為15.30μg／ml,樣品溶液的pH值為2,吸附流速是6BV／h,溫度是25℃,上樣液的體積是30BV。梯度洗脫程序?yàn)?先用去離子水除雜質(zhì),再用3BV30％乙醇水溶液去除大部分雜質(zhì),最后用8BV60％乙醇水溶液洗脫大部分三孢酸,洗脫流速為9BV／h。經(jīng)過(guò)大孔吸附樹(shù)脂SP850處理后的三孢酸的純度可以達(dá)到70％。
　　

5、 首次采用制備型高效液相色譜分離三孢酸,分離條件為:55％甲醇水溶液為流動(dòng)相,流速為10ml／min,上樣量應(yīng)控制在20mg以內(nèi),并利用MS和1H-NMR表征產(chǎn)品的結(jié)構(gòu),確認(rèn)其為三孢酸C。
　　 研究了在三孢布拉氏霉菌的“-”菌發(fā)酵過(guò)程中添加三孢酸及其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物β-紫羅酮和脫落酸對(duì)β-胡蘿卜素生物合成的影響,其中,三孢酸、β-紫羅酮和脫落酸的最適添加濃度分別為9.10μM、50μM和0.909μM,β-胡蘿卜素的產(chǎn)量分別提高了7

6、0.4％、47.2％和43.4％。
　　 研究了三孢布拉氏霉菌的“-”菌添加三孢酸、β-紫羅酮和脫落酸對(duì)類(lèi)胡蘿卜素合成途徑上兩個(gè)關(guān)鍵基因carRA和carB轉(zhuǎn)錄水平的影響,其中三孢酸提高carRA和carB基因的表達(dá)倍數(shù)是最顯著的,分別在6h和3h時(shí)影響程度最大,分別提高了3.24倍和9.93倍；脫落酸對(duì)于carRA基因和carB基因轉(zhuǎn)錄水平的影響都在培養(yǎng)3h時(shí)達(dá)到最大,分別提高了1.97倍和7.85倍。β-紫羅酮對(duì)于carRA