黃綠木霉和球孢白僵菌幾丁質降解酶基因的克隆與表達.pdf

1、幾丁質降解酶是一組能降解幾丁質，生成幾丁低聚糖的酶的總稱。幾丁質是由β-1，4糖苷鍵連接的N-乙酰氨基葡萄糖的多聚物，是儲量僅次于纖維素的第二大生物資源。本文通過基因工程的方法克隆幾丁質降解酶基因，轉入釀酒酵母中，為大量生產幾丁質降解酶奠定基礎。 黃綠木霉(Trichodermaaureoviride)和球孢白僵菌(Beauveriabassiana)是自然界普遍存在的真菌，具有高效的幾丁質降解酶體系。本文以黃綠木霉(T.aur

2、eoviride)和球孢白僵菌(B.bassiana)為出發(fā)菌株；采用PCR方法克隆到黃綠木霉(T.aureoviride)和球孢白僵菌(B.bassiana)幾丁質降解酶基因ech42、chit1、chit2和cns1DNA片段，測序后將這些基因DNA片段構建到釀酒酵母(S.cerevisiae)誘導型表達載體pYES2上，轉化獲得的轉化子經(jīng)誘導，用Northern雜交驗證了目的基因的轉錄表達。采用DNS法，分別以膠態(tài)幾丁質為底物，研

3、究了各個轉化子的酶活性、培養(yǎng)周期，重組酶的最適溫度和pH值，以及重組酶的協(xié)同作用。 本文從黃綠木霉(T.aureoviride)和球孢白僵菌(B.bassiana)菌株的DNA中，通過引物設計，用PCR方法克隆得到了ech42、chit1、chit2、cns1的DNA片段，共4個基因片段。對其中的DNA片段進行測序，證實得到了全部是幾丁質降解酶基因的DNA片段。來源于黃綠木霉的幾丁質酶基因ech42序列遞交國際權威基因數(shù)據(jù)庫Ge

4、nBank，經(jīng)審核確認沒有與數(shù)據(jù)庫中重復的序列后，將該序列在數(shù)據(jù)庫上發(fā)表，序列號為AY850032。添補了國際權威基因數(shù)據(jù)庫GenBank在黃綠木霉幾丁質酶基因這一內容上的空白。 將克隆到的4個目的基因構建到帶有高效啟動子的釀酒酵母表達載體pYES2上，得到4個重組質粒。用釀酒酵母完整細胞轉化法將以上4個重組質粒轉入釀酒酵母(S.cerevisiae)H158細胞中，通過釀酒酵母菌落PCR和雙酶切鑒定證實了轉化的成功，得到了帶有

5、4種幾丁質降解酶基因DNA片段的釀酒酵母(S.cerevisiae)H158轉化子。 對轉化子的Northern雜交檢測分別得到了與預期大小相符的雜交信號帶，證實了各個幾丁質降解酶基因DNA片段在GAL1啟動子控制下經(jīng)半乳糖誘導在釀酒酵母(S.cerevisiae)中成功轉錄表達；并通過DNS法研究了各個轉化子的發(fā)酵周期，發(fā)現(xiàn)ech42、chit1、chit2和cns1轉化子產酶高峰的出現(xiàn)時間分別為36h、48h、36h和48h

6、(接種量為5mL)，各轉化子酶活的最大值分別為0.50、0.47、0.63、和0.62UmL-1；各重組酶的最適反應溫度分別為Ech4240℃、Chit170℃、Chit270℃、Cns170℃各重組酶的最適pH值分別為Ech42g.0、Chit18.0、Chit25.0、Cns14.6。比較了在相同條件下4種轉化子分泌的重組酶的協(xié)同作用，結果表明在相同條件下4種重組酶不同組合的酶活差異十分顯著。在所有的組合當中，Cns1和chit1組

7、合的酶活最高0.75UmL-1，Chit1和Chit2組合酶活最低0.21UmL-1。重組酶Ech42和Cns1與其它重組酶之間存在正協(xié)同效應，Chit1和Chit2之間是負協(xié)同效應。 黃綠木霉(T.aureoviride)和球孢白僵菌(B.bassiana)的幾丁質降解酶基因DNA片段的克隆，為進一步研究幾丁質降解酶基因在釀酒酵母(S.cerevisiae)等其他細胞中的表達及重組酶的特性提供了重要的材料；為其他有關抗病抗蟲基

8、因工程提供了重要基因資源。通過對轉化子的發(fā)酵周期和重組酶的酶學特性分析證實了釀酒酵母(S.cerevisiae)可以正確表達黃綠木霉(T.aureoviride)和球孢白僵菌(B.bassiana)的幾丁質降解酶基因的DNA片段，為構建可大量生產幾丁質降解酶的酵母工程菌提供了重要理論依據(jù)。實驗中四種幾丁質降解酶存在不同的協(xié)同作用的結果，為進一步研究其他不同的幾丁質降解酶組合的協(xié)同作用提供了新的思路，對進一步研究幾丁質降解酶的實際應用具有