微生物法不對稱還原合成手性2-辛醇的研究.pdf

1、光學(xué)純2-辛醇是光電材料、醫(yī)藥、農(nóng)藥和精細(xì)化工產(chǎn)品的重要手性中間體。通過開展生物法催化高效制備光學(xué)純2-辛醇，對于取代現(xiàn)有的化學(xué)法以及深入手性生物催化的研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和理論價(jià)值。 本文從包括酵母、細(xì)菌和霉菌在內(nèi)的菌株中篩選得到還原2-辛酮生成手性2-辛醇效果較好的2株菌株。其中CandidaboidiniiCECT10035能夠還原2-辛酮得到(S)-2-辛醇，當(dāng)?shù)孜餄舛葹?0g/L時(shí)，轉(zhuǎn)化率為32.6％，e.e.值為9

2、5.6％。另一株OenococcusoeniCECT4730則是能還原2-辛酮得到(R)-2-辛醇，在同樣底物濃度下，轉(zhuǎn)化率為99.8％，e.e.值為97.6％。酒明串珠菌具有較高的酮還原能力以及光學(xué)選擇性，是首次報(bào)道。 對OenococcusoeniCECT4730催化還原2-辛酮的反應(yīng)體系進(jìn)行研究，優(yōu)化其反應(yīng)體系及反應(yīng)條件為：細(xì)胞濃度250g/L，底物濃度0.5M，采用葡萄糖作為輔助底物，濃度為300mM，水相為300mMT

3、ris-Borate(TBE)緩沖液，pH為8.5，有機(jī)相為正壬烷，兩相比為1∶1，搖瓶轉(zhuǎn)速為150rpm，反應(yīng)溫度30℃，反應(yīng)48小時(shí)，在培養(yǎng)菌體過程中通CO2，同時(shí)反應(yīng)前通惰性氣體N2作為保護(hù)氣，并保持厭氧。在最優(yōu)條件下，產(chǎn)物的光學(xué)純度提高至99％e.e.，轉(zhuǎn)化率保持99％。 在以上優(yōu)化過程中發(fā)現(xiàn)高濃度的底物，輔助底物和TBE緩沖液對反應(yīng)有抑制，因此采用底物流加反應(yīng)來降低以上因素對反應(yīng)的抑制。其流加反應(yīng)體系為：流加過程中細(xì)胞

4、濃度為180g/L，維持底物濃度為10g/L左右，同時(shí)將出發(fā)的TBE緩沖液pH改為7.5，流加過程中維持pH在7.5附近，流加中用于調(diào)節(jié)pH的Tris液濃度為0.3M，輔助底物葡萄糖也是0.3M。經(jīng)過48小時(shí)的流加反應(yīng)，產(chǎn)物濃度達(dá)到120g/L，并且轉(zhuǎn)化率和e.e.值均達(dá)到99％。 利用OenococcusoeniCECT4730還原不同酮化合物，發(fā)現(xiàn)其胞內(nèi)的醇脫氫酶具有較廣的底物特異性，即能還原脂肪酮類化合物，又能還原芳香酮類

5、化合物，并且產(chǎn)物的光學(xué)純度都較高。在酮底物的選擇性上，尤其適合于還原在羰基一側(cè)具有一個(gè)甲基，在另一側(cè)有一個(gè)較大基團(tuán)的酮化合物。通過對其粗酶的研究發(fā)現(xiàn)，其胞內(nèi)的醇脫氫酶是NADPH依賴型的，并且在還原輔酶過程中的一個(gè)關(guān)鍵的酶是6-磷酸葡萄糖脫氫酶。 還研究了OenococcusoeniCECT4730在還原反應(yīng)過程中的輔酶循環(huán)系統(tǒng)，其主要通過PK途徑代謝葡萄糖并用于再生輔酶，并且大約一分子的葡萄糖被代謝，就會再生二分子的NADPH

6、用于還原2-辛酮生成二分子2-辛醇，同時(shí)產(chǎn)生一分子的乳酸和乙酸。 針對輔酶再生體系的特性，發(fā)現(xiàn)添加離子和乙醇會提高其輔酶再生體系的轉(zhuǎn)化效率，通過反應(yīng)優(yōu)化，確定在反應(yīng)體系中添加2.5mM的Mn2+和Fe2+，以及10mM的乙醇。優(yōu)化后，單批次反應(yīng)的轉(zhuǎn)化能力比之前的單批次優(yōu)化結(jié)果又提高50％。 最后利用CandidaboidiniiCECT10035全細(xì)胞催化手性合成(S)-2-辛醇，將其反應(yīng)體系及反應(yīng)條件優(yōu)化為：細(xì)胞濃度2