傷寒沙門菌非編碼RNA S527表達(dá)特性與作用研究.pdf

1、目的:
　　近來(lái)通過(guò)生物學(xué)預(yù)測(cè)方法以及計(jì)算機(jī)分析等實(shí)驗(yàn)手段，已在細(xì)菌的基因組中發(fā)現(xiàn)了許多非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)，它們可作為重要的調(diào)節(jié)因子，參與調(diào)控細(xì)菌的基因表達(dá)。本課題組通過(guò)利用傷寒沙門菌(Salmonella enterica serovar Typhi，S.Typhi)轉(zhuǎn)錄組深度測(cè)序及生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)了一系列疑似ncRNA，本研究將對(duì)其中之一疑似ncRNAS527進(jìn)行分子鑒定、表達(dá)特性分析

2、及作用與功能等研究。
　　方法:
　　1.S527分子鑒定:通過(guò)northern blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)S527在S.Typhi有表達(dá);利用5' RACE和Tiling PCR的方法，分析S527基因的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)以及可能的轉(zhuǎn)錄終止點(diǎn)，確定其基因位置和分子的全長(zhǎng)。
　　2.S527的表達(dá)特性分析:采用northern blot和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)實(shí)驗(yàn)，分析S.Typhi在不同生長(zhǎng)時(shí)相和酸、氧、高滲環(huán)境應(yīng)激后的

3、S527表達(dá)變化。
　　3.S527基因缺陷變異株的制備:利用λ-Red同源重組方法，制備的(114bp)缺失變異株。
　　4.S527高表達(dá)株的制備:構(gòu)建含S527基因全長(zhǎng)的高表達(dá)重組載體pBAD-S527，導(dǎo)入S.Typhi作為S527高表達(dá)菌株。
　　5.S527作用分析:將野生株、變異株、高表達(dá)菌株及空質(zhì)粒對(duì)照株在LB中及酸、氧和高滲條件下培養(yǎng)，分別測(cè)OD600，繪制生長(zhǎng)曲線，觀察S527對(duì)S.Typhi生長(zhǎng)的

4、影響;將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各菌株，接種至含0.3％瓊脂糖的LB動(dòng)力平板中，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，測(cè)量菌株圈直徑，分析S527對(duì)S.Typhi動(dòng)力的影響。
　　結(jié)果:
　　1.Northern blot結(jié)果顯示，S.Typhi野生株中有與S527特異性cDNA探針結(jié)合的RNA，長(zhǎng)約700-800nt，表明S527在S.Typhi確有表達(dá);5'RACE結(jié)果顯示，S527基因的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)位于ribE基因翻譯轉(zhuǎn)錄終止點(diǎn)下游963nt處;Tili

5、ng PCR結(jié)果顯示，S527基因的終止區(qū)位于基因下游755-817bp之間，期間無(wú)明顯的蛋白編碼ORF結(jié)構(gòu)。
　　2.Northern blot和qRT-PCR實(shí)驗(yàn)顯示，S527在S.Typhi的對(duì)數(shù)中后期(OD6000.8)表達(dá)最高，在酸、氧及高滲應(yīng)激下表達(dá)下調(diào)。
　　3.S527基因序列分析顯示，S527基因中114bp被卡那霉素抗性基因替代，表明S527基因缺陷株制備成功。
　　4.生長(zhǎng)曲線表明，S527缺陷株

6、在各種應(yīng)激下生長(zhǎng)能力較野生株低，但在酸應(yīng)激8小時(shí)后S527缺陷株生長(zhǎng)能力逐漸恢復(fù)。S527高表達(dá)株較野生株及空質(zhì)粒對(duì)照株的生長(zhǎng)能力稍低，但無(wú)顯著差異。
　　5.動(dòng)力實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，S527高表達(dá)菌株動(dòng)力較野生株及空質(zhì)粒對(duì)照株動(dòng)力明顯增高。
　　結(jié)論:
　　1.S527為一長(zhǎng)鏈ncRNA，在S.Typhi確有表達(dá)，且對(duì)數(shù)中后期表達(dá)最高;環(huán)境應(yīng)激可影響S527的表達(dá)。
　　2.S527基因缺陷可影響S.Typhi的生長(zhǎng)