傷害沙門菌非編碼RNA AsrC的相關(guān)功能研究.pdf

1、目的:
　　 近十年來(lái)，通過(guò)生物學(xué)預(yù)測(cè)和計(jì)算機(jī)分析、基因芯片篩查以及高通量測(cè)序等手段，在細(xì)菌基因組內(nèi)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一批非編碼RNA(non-codingRNA，ncRNA)，它們作為基因表達(dá)的調(diào)控因子，在細(xì)菌中發(fā)揮重要作用。AsrC為本實(shí)驗(yàn)室在傷寒沙門菌中新發(fā)現(xiàn)的ncRNA，其基因位于rseC的互補(bǔ)鏈，本論文擬研究該非編碼RNA在傷寒沙門菌中的相關(guān)功能。
　　 方法:
　　 1.傷寒沙門菌AsrC高表達(dá)菌株的構(gòu)建。根

2、據(jù)Northern鑒定出的AsrC，以及5’和3'RACE（末端快速擴(kuò)增技術(shù)）找到的轉(zhuǎn)錄起始及終止位點(diǎn)，從前期測(cè)序中找到該段全長(zhǎng)序列。在5’起始端上游140bp處和3’終止端處分別設(shè)計(jì)上下游引物，擴(kuò)增獲得目的片段，經(jīng)NcoⅠ和HindⅢ雙酶切，與同樣酶切后的低拷貝質(zhì)粒pBAD/Myc-HisA定向連接，并克隆至大腸埃希菌TOP10。經(jīng)PCR、酶切驗(yàn)證和測(cè)序分析鑒定后，將陽(yáng)性重組質(zhì)粒和空質(zhì)粒分別電擊導(dǎo)入傷寒沙門菌野生株，作為AsrC高表達(dá)

3、菌株和空質(zhì)粒對(duì)照株。
　　 2.AsrC高表達(dá)菌株在不同條件下的生長(zhǎng)曲線測(cè)定。以生長(zhǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD600值為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線，對(duì)比AsrC高表達(dá)菌株和空質(zhì)粒對(duì)照株在正常及酸、氧、高滲應(yīng)激條件下的生長(zhǎng)情況。
　　 3.AsrC高表達(dá)菌株的基因表達(dá)譜分析。將AsrC高表達(dá)菌株和空質(zhì)粒對(duì)照株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期(OD6000.4)，加入0.2％(w/v)的阿拉伯糖誘導(dǎo)1h后分別提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA并配對(duì)互標(biāo)熒光素cy3

4、和cy5，利用傷寒沙門菌全基因組芯片分析技術(shù)，與基因組芯片雜交，掃描后將熒光信號(hào)數(shù)據(jù)化，分析比較傷寒沙門菌AsrC高表達(dá)菌株和空質(zhì)粒對(duì)照株的基因表達(dá)譜差異。
　　 4.AsrC高表達(dá)菌株的動(dòng)力實(shí)驗(yàn)。將AsrC高表達(dá)菌株和空質(zhì)粒對(duì)照株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期(OD6000.4)后加入0.2％(w/v)的阿拉伯糖誘導(dǎo)1h，分別取野生株、asrC啟動(dòng)子缺失株、AsrC高表達(dá)菌株和空質(zhì)粒對(duì)照株的2.5μl菌液點(diǎn)種于0.3％的等滲半固體LB培養(yǎng)基，3

5、7℃培養(yǎng)8h后測(cè)量動(dòng)力圈直徑，兩兩比較細(xì)菌的動(dòng)力。
　　 5.AsrC高表達(dá)菌株的上皮細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)。將AsrC高表達(dá)菌株和空質(zhì)粒對(duì)照株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期(OD6000.4)，在0.2％（w/v）的阿拉伯糖誘導(dǎo)1h后，分別把野生株、asrC啟動(dòng)子缺失株、AsrC高表達(dá)菌株和空質(zhì)粒對(duì)照株加入培養(yǎng)有HeLa細(xì)胞的24孔板中（MOI均為20）。培養(yǎng)90min后將部分孔的細(xì)胞破膜，收集菌體后涂板過(guò)夜，菌落數(shù)代表細(xì)菌粘附細(xì)胞水平(T0);另一部分

6、孔的細(xì)胞加入慶大霉素繼續(xù)培養(yǎng)90min后，破膜涂板過(guò)夜，菌落數(shù)代表細(xì)菌侵襲水平(T90)，以T90/T0值代表細(xì)菌的侵襲力。
　　 6.AsrC高表達(dá)菌株在THP-1細(xì)胞內(nèi)生存實(shí)驗(yàn)。將AsrC高表達(dá)菌株和空質(zhì)粒對(duì)照株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期(OD6000.4)，在0.2％(w/v)的阿拉伯糖誘導(dǎo)1h后，分別把野生株、asrC啟動(dòng)子缺失株、AsrC高表達(dá)菌株和空質(zhì)粒對(duì)照株加入培養(yǎng)有THP-1細(xì)胞的24孔板中（MOI均為10）。培養(yǎng)1h后加入慶

7、大霉素，再作用1h后將部分孔的細(xì)胞破膜，收集菌體后涂板過(guò)夜，計(jì)菌落數(shù)(T0)表示基礎(chǔ)細(xì)菌吞噬水平;另一部分孔的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)12或24h，破膜后涂板過(guò)夜，菌落數(shù)(T12或T24)代表胞內(nèi)細(xì)菌增殖水平，T12/T0和T24/T0表示細(xì)菌在THP-1細(xì)胞內(nèi)生存力。
　　 7.qRT-PCR對(duì)傷寒沙門菌rseCmRNA的穩(wěn)定性分析。將AsrC高表達(dá)菌株和空質(zhì)粒對(duì)照株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期(OD6000.4)，不加或加入0.2％（w/v）的阿拉伯糖

8、繼續(xù)培養(yǎng)5、10、20min，以TRIzol提取總RNA后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR，分析rseCmRNA的水平變化趨勢(shì)。
　　 結(jié)果:
　　 1.經(jīng)酶切驗(yàn)證和測(cè)序分析鑒定，成功構(gòu)建pBAD-asrC陽(yáng)性重組載體，并將該1034bp的asrC高表達(dá)片段導(dǎo)入野生株GIFU10007，表明傷寒沙門菌AsrC高表達(dá)菌株制備成功。
　　 2.生長(zhǎng)曲線表明，在正常及酸、氧、高滲應(yīng)激條件下，AsrC高表達(dá)菌株和空質(zhì)粒對(duì)照株并

9、無(wú)明顯差異。
　　 3.基因芯片結(jié)果顯示，高表達(dá)AsrC后，有41個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，主要涉及鞭毛、侵襲和代謝相關(guān)基因;有23個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，主要為代謝相關(guān)基因。
　　 4.動(dòng)力實(shí)驗(yàn)表明，asrC啟動(dòng)子缺失株的動(dòng)力比野生株有所下降，而AsrC高表達(dá)菌株的動(dòng)力較空質(zhì)粒對(duì)照株明顯升高。
　　 5.與野生株相比，asrC啟動(dòng)子缺失株對(duì)上皮細(xì)胞的侵襲力有所降低，而高表達(dá)AsrC后的菌株在侵襲力上較空質(zhì)粒對(duì)照株有明顯提高。

10、r>　　 6.與野生株相比，asrC啟動(dòng)子缺失株在THP-1細(xì)胞內(nèi)的生存能力無(wú)明顯變化，而高表達(dá)AsrC后的菌株在生存能力上較空質(zhì)粒對(duì)照株有所下降。
　　 7.qRT-PCR結(jié)果顯示，AsrC的高表達(dá)可以提高rseCmRNA的穩(wěn)定性。
　　 結(jié)論:
　　 傷寒沙門菌的非編碼反義RNAAsrC在高表達(dá)后，對(duì)細(xì)菌在正常及酸、氧、高滲應(yīng)激條件下的生長(zhǎng)無(wú)明顯影響;但其可影響細(xì)菌的動(dòng)力、侵襲力及胞內(nèi)生存力;同時(shí)其可增強(qiáng)r