非編碼小RNA RyhB-1與IsrE在腸炎沙門氏菌致病性上的相互作用研究.pdf

1、RyhB是一種大小為90bp左右的細(xì)菌非編碼小RNA，可在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。前人研究表明存在于鼠傷寒沙門氏菌和霍亂弧菌中的兩種RyhB同源物RyhB-1與IsrE可調(diào)控細(xì)菌生物膜形成、趨化性和耐酸性。本研究對腸炎沙門氏菌sRNA RyhB兩種同源物RyhB-1與IsrE在腸炎沙門氏菌致病性上的作用，以及兩種同源物能否對毒力調(diào)控發(fā)揮協(xié)同作用進(jìn)行了如下的研究。
　　1.腸炎沙門氏菌50336RyhB-1與IsrE在不同環(huán)境下表

2、達(dá)量檢測
　　根據(jù)腸炎沙門氏菌RyhB-1與IsrE序列設(shè)計(jì)引物，利用熒光定量PCR反應(yīng)檢測二者在腸炎沙門氏菌不同生長時(shí)期時(shí)處于鐵匱乏、模擬腸道環(huán)境、感染巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)條件下的表達(dá)量，分析RyhB-1與IsrE在不同培養(yǎng)時(shí)期和不同培養(yǎng)條件時(shí)表達(dá)量的變化規(guī)律尤其是模擬宿主內(nèi)環(huán)境時(shí)表達(dá)情況，結(jié)果顯示，在鐵匱乏條件下，對數(shù)期時(shí)，RyhB-1與IsrE的表達(dá)水平均比普通LB培養(yǎng)時(shí)高2倍，穩(wěn)定期時(shí)，RyhB-1與IsrE的表達(dá)量分別是普通L

3、B培養(yǎng)條件下的2.5倍和3倍，表明兩種sRNA表達(dá)量的升高與該菌在缺鐵環(huán)境中需要高效吸收鐵有關(guān)，推測兩種sRNA可調(diào)控鐵代謝。模擬腸道環(huán)境下，對數(shù)期時(shí)RyhB-1與IsrE的表達(dá)水平與普通LB培養(yǎng)時(shí)相比，分別上升3.5倍和3倍，穩(wěn)定期時(shí)上升1.3倍和1.5倍。與感染巨噬細(xì)胞前相比，感染1h和4h時(shí)，RyhB-1的表達(dá)水平分別上升2倍與5.5倍，IsrE的表達(dá)水平分別上升4.5倍與8.5倍。表明了RyhB-1與IsrE在受到環(huán)境變化壓力下

4、被誘導(dǎo)表達(dá)使表達(dá)量顯著升高，IsrE的表達(dá)水平變化高于RyhB-1，推測二者均與腸炎沙門氏菌的毒力相關(guān)，但對毒力的調(diào)控方式可能不同。
　　2.腸炎沙門氏菌50336RyhB-1與IsrE雙缺失突變株及相應(yīng)回補(bǔ)株構(gòu)建
　　本課題前期利用λ-Red同源重組系統(tǒng)構(gòu)建了ryhB-1和isrE單基因缺失株，本研究將繼續(xù)利用同源重組系統(tǒng)構(gòu)建出ryhB-1和isrE雙基因缺失株，在此基礎(chǔ)上，分別設(shè)計(jì)含有ryhB-1和isrE序列和上下游非

5、編碼序列以及酶切位點(diǎn)的引物，利用pBR322表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建isrE單缺失株的回補(bǔ)株50336△isrE/pisrE，利用pACYC184表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建ryhB-1單缺失株的回補(bǔ)株50336△ryhB-1/pryhB-1，利用pBR322表達(dá)質(zhì)粒和pACYC184表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建ryhB-1和isrE雙缺失株的回補(bǔ)株50336△ryhB-1/△isr E/pryh B-1/pisrE，為進(jìn)一步探索sRNA RyhB的兩種同源物ryhB-1和isr

6、E在腸炎沙門氏菌致病過程中的作用提供材料。
　　3.體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)分析腸炎沙門氏菌50336 RyhB-1與IsrE在致病性方面的作用
　　通過腸炎沙門氏菌野生株50336、ryhB-1和isrE單雙基因缺失株以及相應(yīng)的回補(bǔ)株檢測細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)能力、生物膜形成能力、對各運(yùn)動(dòng)性關(guān)鍵基因表達(dá)量、對宿主細(xì)胞的侵襲力和黏附力、對巨噬細(xì)胞的抗吞噬力與在巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活率、對易感動(dòng)物1日齡雛雞的半數(shù)致死量，死亡率，體內(nèi)細(xì)菌分布，分析RyhB-1