PD-L1-IgG1融合蛋白維持DC未成熟狀態(tài)在誘導心臟移植免疫耐受中的效應與機制研究.pdf

1、樹突狀細胞(dendritic cells，DC)是一類功能強大，并且是唯一能夠激活初始T細胞的抗原提呈細胞，在識別和提呈抗原、啟動免疫應答、誘導移植排斥反應中起著重要的作用。由于DC是一類異質(zhì)性細胞群體，具有不同的亞群和不同的功能狀態(tài)，不但在增強免疫反應上具有重要的作用，也具有抑制排斥反應、誘導特異性免疫耐受的潛力。有研究表明，未成熟DC缺乏共刺激分子CD80(B7-1)和CD86(B7-2)的表達，體外能夠誘導同種抗原特異性的T細胞

2、失能。體內(nèi)未成熟DC存在著自然發(fā)育成熟的內(nèi)在機制，而且器官移植術后受者體內(nèi)產(chǎn)生的多種介質(zhì)，如致炎性細胞因子、LPS等，均能促進DC分化成熟，使之擁有強大的免疫原性。因此，一些調(diào)控手段，如免疫抑制分子1，25-二羥維生素D共培養(yǎng)或白細胞介素10(interleukin10，IL-10)、轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming factorβ，TGF-β)等修飾，可以使DC維持于穩(wěn)定的未成熟狀態(tài)，增強其耐受原性，是減輕移植排斥反應、誘導特

3、異性免疫耐受的重要途徑并具有潛在的臨床應用價值。
　　根據(jù)多個實驗室的研究報道，PD-L1對T細胞反應的影響有共刺激和抑制兩種作用情況，具體機理尚未完全闡明，目前尚有爭議性。已有學者指出T細胞受刺激活化5～15分鐘后，B7-H1和B7-DC先與其第二未明活化受體結合，上調(diào)T細胞表面CD40L的表達，促進T細胞的進一步活化;而24小時后，T細胞開始表達PD-1，PD-L/ PD-1途徑占主導作用，介導T細胞的凋亡并下調(diào)細胞因子的分泌

4、，對T細胞的增殖產(chǎn)生抑制作用。PD-L1/PD-1共刺激途徑可抑制T細胞受體介導的淋巴細胞增殖反應和細胞因子分泌，B7-H1缺陷鼠的表型亦表明B7-H1在體內(nèi)有重要的負性調(diào)節(jié)作用。PD-L1/PD-1通路在移植免疫中起著重要作用。PD-L1/PD-1通路可抑制移植動脈病(graft arterial disease，GAD)。也有研究表明，PD-L1/PD-1通路提供給T細胞信號，影響著急性移植物抗宿主病(graft-vs-host d

5、isease，GVHD)的致死率。
　　鑒于PD-L1對DC發(fā)育及免疫功能的重要調(diào)控作用，我們設想采用新型基因工程技術致敏未成熟DC，將會減緩或阻止DC的成熟過程，體內(nèi)回輸有利于減輕排斥反應，并可能誘導穩(wěn)定、有效的供者特異性免疫耐受。
　　本研究通過構建高表達mPD-L1-IgG1融合蛋白的酵母菌株，純化制備mPD-L1-IgG1融合蛋白;體外培養(yǎng)、擴增并富集小鼠骨髓來源的DC，采用融合蛋白致敏未成熟DC，研究mPD-L1-

6、IgG1致敏的未成熟DC的表型及功能的變化，以及體外誘導同種抗原特異性T細胞低反應性的作用和效果;通過建立小鼠同種異體異位心臟移植模型，觀察mPD-L1-IgG1-DC體內(nèi)減輕排斥反應、誘導心臟移植免疫耐受的效果，并探討了可能的機制。
　　第一部分 酵母表達的PD-L1-IgG1融合蛋白表達、純化和鑒定
　　一、酵母表達mPD-L1/mIgG1Fc工程菌的構建
　　目的:構建高表達mPD-L1/mIgG1Fc的酵母工程

7、菌。
　　方法:將mPD-L1基因與mIg基因依次定向克隆入酵母pPIC9k載體構建pPIC9k-mPD-L1-Ig融合基因表達質(zhì)粒;以表達質(zhì)粒電穿孑L酵母感受態(tài)菌GS115，經(jīng)MD板營養(yǎng)篩選、和G418+抗性篩選高拷貝酵母菌株。
　　結果:成功構建了高表達PD-L1-IgG1融合蛋白的酵母菌株。
　　結論:構建了mPD-L1/mIgG1Fc酵母表達的工程菌，為下一步蛋白純化研究打下了良好基礎。
　　二、mPD-

8、L1-mIgG1-Fc融合蛋白的表達與純化研究
　　目的:將成功構建了高表達PD-L1-IgG1融合蛋白的酵母菌株進行純化、鑒定。
　　方法:探索不同誘導時間和溶解氧含量對融合蛋白發(fā)酵表達產(chǎn)量的影響;探索和優(yōu)化酵母上清中融合蛋白的各種純化制備條件;建立新型融合蛋白的鑒定方法。
　　結果:確定了酵母菌株的發(fā)酵條件是發(fā)酵72小時，甲醇誘導濃度是8ml/h，優(yōu)化了融合蛋白的純化方法，建立了mPD-L1-Ig融合蛋白的純化流程

9、，最終獲得了純度＞95％的mPD-L1-IgG1融合蛋白，內(nèi)毒素含量低于0.03pg/μg蛋白。
　　結論:制備了符合生物學功能實驗要求的mPD-L1-Ig融合蛋白，為進一步開展功能研究打下了良好基礎。
　　第二部分 PD-L1-IgG1融合蛋白維持DC未成熟狀態(tài)和低反應性
　　目的:建立PD-L1-IgG1融合蛋白致敏DC方法，研究融合蛋白維持DC未成熟狀態(tài)和誘導DC低反應性的能力。
　　方法:用mPD-L1-

10、IgG1融合蛋白致敏體外擴增的第5天的BALB/c小鼠骨髓來源的未成熟DC，流式細胞儀檢測LPS刺激前后致敏DC的表型改變;將BALB/c來源的LPS-DC、imDC和mPD-L1-IgG1-DC，以不同比例與C57BL/6小鼠來源的T細胞進行混合淋巴細胞反應(MLR)，并檢測反應上清中細胞因子的含量;將BALB/c小鼠來源的imDC和mPD-L1-IgG1致敏DC分別經(jīng)尾靜脈注入C57BL/6小鼠體內(nèi)（2×106細胞/只），7天取受者

11、脾臟，檢測受者脾臟T細胞與供者和無關第三者脾臟淋巴細胞的MLR情況。
　　結果:致敏DC表面高表達mPD-L1-IgG1融合蛋白，致敏DC能有效抵抗LPS刺激而維持未成熟狀態(tài)，其表面CD80、CD86及HLA-DR等分子的表達下調(diào);MLR反應中致敏DC刺激同種異基因T細胞增殖的能力顯著低于對照組，分泌Th1因子(IL-2、IFN-γ)顯著下降， Th2因子(IL-4、TGF-β)則明顯上升;致敏DC免疫組脾臟T淋巴細胞接觸供者抗原

12、時，表現(xiàn)出明顯的低反應性。
　　結論: mPD-L1-IgG1能有效致敏未成熟DC，維持DC表型和功能保持未成熟狀態(tài)，誘導DC低反應性。
　　第三部分 小鼠心臟移植急性排斥反應模型的建立
　　目的:建立可用于移植急性排斥反應研究的小鼠心臟移植模型。
　　方法:實驗組的供、受體分別來自BALB/c小鼠和C57BL/6小鼠;對照組的供、受體來自BALB/c小鼠，每組各20對。采用Cuff血管吻合技術，在小鼠頸部進行異

13、位心臟移植。心臟移植術后第7天，每組10只取移植心臟組織，用石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅染色，進行組織病理學分析。觀察每組其余存活受體小鼠的移植心臟存活期。
　　結果:手術成功率達92.5％(37/40)。移植后第7天病理組織檢查結果顯示:實驗組排斥反應等級為3.55±0.44，對照組為0.40±0.32，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。實驗組移植心臟存活(8.22±0.67)d，對照組移植心臟存活＞100 d，兩組比較

14、差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　結論:采用Cuff血管吻合技術，將BALB/c小鼠心臟移植至C57BL/6小鼠，可以建立穩(wěn)定的小鼠心臟移植急性排斥反應模型。該方法手術成功率高，值得推廣。
　　第四部分 PD-L1-IgG1-DC誘導小鼠心臟移植免疫耐受的作用和機制
　　目的:建立PD-L1-IgG1-DC誘導小鼠心臟移植免疫耐受模型，探索其體內(nèi)負向免疫作用機制。
　　方法:選擇C57BL/6小鼠為受體，在

15、移植前7天，經(jīng)尾靜脈注入BALB/c小鼠來源的Day5-DC和PD-L1-IgG1-DC(2×106細胞/只)，PBS組為對照，進行頸部異位心臟移植術，觀察各組心臟移植物的存活期;術后第7天觀察心臟移植物的病理改變，并測定體內(nèi)血清細胞因子水平;分析受者脾臟T細胞對供者抗原的刺激反應和CTL效應。
　　結果:PD-L1-IgG1-DC組心臟移植物平均存活天數(shù)為(24.2±3.29)d，比Day5-DC組和對照組均明顯延長(P＜0.0

16、1);致敏DC組心臟移植物的病理改變明顯輕于其它2組，血清中Th1細胞因子(IL-2、IFN-γ)水平較其它2組減低，而Th2細胞因子TGF-β水平升高、IL-4水平無明顯差異;PD-L1-IgG1-DC組脾臟淋巴細胞對供者抗原的刺激反應下降明顯(P＜0.01)，其在CTL反應中對靶細胞的殺傷活性明顯弱于Day5-DC組和對照組(P＜0.01); PD-L1-IgG1-DC免疫組小鼠體內(nèi)的CD4+CD25+Foxp3+ Treg調(diào)節(jié)性T

17、細胞顯著升高。
　　結論:PD-L1-IgG1-DC能夠有效誘導小鼠心臟移植的免疫耐受，具有較強的免疫負向應答調(diào)控性能，其免疫負向調(diào)控功能主要由PD-L1誘生。
　　全文總結
　　mPD-L1-IgG1融合蛋白可以有效致敏未成熟DC，制備mPD-L1-IgG1-DC，該新型DC在體外可抑制同種異基因T細胞的增殖，并抑制Th1細胞因子產(chǎn)生;BALB/c小鼠來源的mPD-L1-IgG1-DC經(jīng)尾靜脈注入C57BL/6小鼠體

18、內(nèi)，可誘導受者對供者的抗原特異性低反應性。應用小鼠同種異體心臟異位移植模型證實，移植前7d經(jīng)尾靜脈注射mPD-L1-IgG1-DC可以有效地延長心臟移植物的存活時間，明顯地減輕移植心臟的病理改變。體內(nèi)作用機制分析表明mPD-L1-IgG1-DC可以借助PD-L1的效應有效誘生調(diào)節(jié)性T細胞從而維持機體免疫耐受狀態(tài)。本實驗研究了mPD-L1-IgG1融合蛋白致敏的DC作為致耐原誘導移植免疫耐受的作用，為進一步探索用免疫負向因子調(diào)控DC亞群防