融合單鏈抗體AChRα1-scFv205靶向未成熟DC誘導(dǎo)免疫耐受預(yù)防EAMG的作用研究.pdf

1、重癥肌無力（Myasthenia gravis，MG）是以波動(dòng)性和非正常的肌肉疲勞為特征的一類自身免疫性疾病。自身抗體通過 B細(xì)胞介導(dǎo)、T細(xì)胞依賴、補(bǔ)體參與從而破壞神經(jīng)肌肉接頭。自身抗體主要包括抗乙酰膽堿受體（Acetylcholine receptor，AChR）（85％病人）抗體、抗肌肉特異性激酶（Muscle-Specific Kinase，Musk）抗體和抗脂蛋白相關(guān)蛋白4（Lipoprotein-Related Protein

2、4，LRP4）抗體?？挂阴Ｄ憠A受體抗體陽性型MG主要是乙酰膽堿受體的α1亞基的胞外域受到攻擊。
　　樹突狀細(xì)胞（Dendtric cells，DCs）是目前發(fā)現(xiàn)功能最強(qiáng)的體內(nèi)抗原遞呈細(xì)胞(Antigen-presenting cells，APC)，其最大的特點(diǎn)就是表型和功能的靈活性。DCs吞噬、消化、呈遞外周抗原給外周器官淋巴結(jié)區(qū)的T細(xì)胞，激活共刺激分子CD40、CD80、CD86等引起免疫反應(yīng)。而未活化的DC，即未成熟樹突狀細(xì)胞

3、（Immature dendritic cell，iDC）可以誘導(dǎo)產(chǎn)生調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Regulatory T cell，treg）或T細(xì)胞無能等，導(dǎo)致抗原外周免疫耐受。DEC205是一種C型凝集素受體，在T細(xì)胞淋巴結(jié)區(qū)的DC上特異性表達(dá)。
　　目前，基于iDC誘導(dǎo)免疫耐受的方法已用于各類自身免疫性疾病的預(yù)防和治療。在以細(xì)胞免疫為主的自身免疫性疾病如實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎、自身免疫性甲狀腺炎和非肥胖性糖尿病動(dòng)物模型中，負(fù)載抗原或免

4、疫優(yōu)勢(shì)肽段的未成熟髓源 DC能有效預(yù)防抗原誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)。
　　目的:
　　利用 R97-116多肽免疫，建立實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥肌無力（Experiment autoimmune myasthenia gravis，EAMG)小鼠模型，并進(jìn)行評(píng)估；體外表達(dá)和純化scFv205和AChRα197-116蛋白，以及二者融合蛋白AChRα1-scFv205，并進(jìn)一步分析AChRα1-scFv205融合蛋白與DC的結(jié)合能力和生物學(xué)

5、活性。最后研究AChRα1-scFv205對(duì)EAMG模型發(fā)病狀況的影響，并探討其中相關(guān)分子機(jī)制。
　　方法:
　　1.利用R97-116多肽混合弗氏佐劑免疫小鼠，經(jīng)三次免疫后觀察其癥狀和體征，測定抗R97-116和抗AChRα1亞基抗體濃度，評(píng)價(jià)EAMG建模效果。
　　2.構(gòu)建和表達(dá)融合單鏈抗體AChRα1-scFv205以及非融合的scFv205和AChRα197-116片段。體外培養(yǎng)小鼠骨髓源性的iDC，利用顯微鏡

6、和掃描電鏡觀察其形態(tài)變化，流式細(xì)胞術(shù)(Flow Cytometry，F(xiàn)CM）檢測其表面共刺激分子和特異性標(biāo)志分子，分析iDC的免疫表型；流式和免疫熒光檢測AChRα1-scFv205與DC的親和力。分別在融合單鏈抗體給予小鼠的第1、21d，MACS分選脾CD11C+DC以及R97-116特異性的CD4+T細(xì)胞，MTT法檢測AChRα1-scFv205對(duì)R97-116特異性CD4+T細(xì)胞增殖活性的影響。
　　3.利用EAMG小鼠模型

7、確定AChRα1-scFv205是否可以預(yù)防EAMG發(fā)病。FCM檢測調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Regulatory T cells，Treg）的比例變化和DC表型。ELISA檢測DC分泌IL-10及TGF-β的水平，以及小鼠血清中抗小鼠AchRα1亞基抗體濃度。
　　結(jié)果
　　1.通過每一月一次皮下注射R97-116及弗氏佐劑，3個(gè)月后，發(fā)現(xiàn)50%的小鼠出現(xiàn)震顫、弓背、肌力下降、體重降低等肌無力癥狀，ELISA結(jié)果顯示，小鼠血清中存在較

8、高濃度的抗R97-116和抗AChRα1亞基抗體，表明成功建立了EAMG小鼠模型。2.分別構(gòu)建scFv205和AChRα197-116，以及AChRα1-scFv205融合表達(dá)的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染大腸桿菌，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，SDS-PAGE和Western-bolt結(jié)果顯示：相對(duì)應(yīng)的大小位置處有目的條帶。采用 Ni2+-NTA柱，成功分離純化了scFv205、AChRα197-116大小位置處和AChRα1-scFv205大小位置處融合蛋白，初

9、步測定純度為75%。分離小鼠骨髓細(xì)胞，經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)，細(xì)胞的形態(tài)符合 DC特征，且經(jīng) LPS誘導(dǎo)后共刺激分子CD40、CD80、CD86表達(dá)水平增加。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，AChRα1-scFv205、scFv205及AChRα197-116對(duì)iDC的親和力分別為41.4%、43.2%和7.0%，表明scFv205與DC之間具有特異性的結(jié)合能力。進(jìn)一步研究結(jié)果顯示，AChRα1-scFv205可以特異性的結(jié)合到脾臟中CD11C+細(xì)胞。分離

10、融合單鏈抗體給予小鼠24h后脾臟的DC，發(fā)現(xiàn)AChRα1-scFv205可以靶向結(jié)合到DC，并刺激R97-116特異性CD4+T細(xì)胞增殖。分離融合單鏈抗體給予小鼠21天后脾臟的DC，發(fā)現(xiàn) AChRα1-scFv205并不能刺激R97-116特異性CD4+T細(xì)胞增殖。這些結(jié)果說明：AChRα1-scFv205能夠特異性結(jié)合DC細(xì)胞，并誘導(dǎo)相關(guān)的免疫耐受反應(yīng)。
　　3.在EAMG小鼠模型中，預(yù)防性給予AChRα1-scFv205，能夠

11、明顯降低EAMG發(fā)病率。進(jìn)一步分析結(jié)果顯示，給予AChRα1-scFv205的小鼠體內(nèi)AChRα1亞基抗體濃度明顯低于單獨(dú)給予AChRα197-116和scFv205（P<0.05）。此外，AChRα1-scFv205能夠維持 DC未成熟表型，增加小鼠脾臟中 CD4+CD25+Foxp3+Treg比例，促進(jìn) DC分泌IL-10和TGF-β。
　　結(jié)論
　　成功構(gòu)建了EAMG小鼠動(dòng)物模型，并獲得了AChRα1-scFv205融