中國人群葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥診斷膜芯片的實驗研究.pdf

1、[目的]
　　 建立基于PCR/RDB技術的用于能同時檢測中國人群常見11種G6PD基因突變類型的診斷膜芯片檢測體系并應用于臨床基因診斷。
　　 [方法]
　　 1.樣本準備用于本研究的11種G6PD基因突變類型，8種突變類型樣本已在臨床收集到，分別為:A95G、G392T、G871A、C1004T、C1024T、G1376T、G1381A、G1388A;3種未收集到的突變類型采用人工誘變方法合成，分別為:C10

2、04A、C1360T、 C1387T。
　　 2.針對中國人群常見的11種G6PD突變類型(A95G、G392T、G871A、C1004T、C1004A、C1024T、C1360T、G1376T、G1381A、C1387T、G1388A)，設計PCR擴增引物和寡核苷酸檢測探針。
　　 3.采用全血基因組提取試劑盒提取外周血樣本基因組DNA，進行多重PCR擴增，在紫外透射儀上觀察結果。
　　 4.反向斑點雜交及顯色

3、將探針按設計的模式固定于尼龍膜上，用生物素標記的擴增產物與處理后的膜雜交。
　　 5.測序驗證將樣品DNA分別進行擴增，產物用相應的正向引物測序。此測序結果作為G6PD基因突變檢測的金標準，以衡量反向點雜交法檢測結果的可靠性。
　　 [結果]
　　 1.反向斑點雜交的結果用11種已知突變樣品作驗證，顯色結果與設計預期相符合，說明本研究建立的反向點雜交檢測方法可用于G6PD11種突變類型的檢測。
　　 2.

4、方法學驗證結果243例臨床樣品采取雙盲法進行反向點雜交法檢測和測序法檢測，結果顯示兩種方法結果完全一致，即:以測序法為金標準，反向點雜交法檢測的符合率為100％。213例G6PD缺乏樣品中，本項目檢出204例突變，突變檢出率為95.8％，最常見的3種突變類型為G1376T、G1388A、A95G;有3種突變類型未檢出，分別為:C1004A、C1360T、C1387T。
　　 [結論]
　　 本研究建立的G6PD基因檢測方