EGCG對體外培養(yǎng)的人毛囊和毛乳頭細胞生物學活性的影響及HIF-1α在人毛囊和毛乳頭細胞中的表達的研究.pdf

1、毛囊是哺乳動物特有的一種結構復雜的皮膚附屬器官，是一個富含干細胞，由神經(jīng)外胚層和中胚層交互作用形成的系統(tǒng)。一生不斷經(jīng)歷生長期、退行期和休止期的周期性循環(huán).毛乳頭對誘導和維持毛囊的周期性循環(huán)必不可少，其大小決定了毛囊的大小和生長期的長短。毛乳頭細胞具有確定和維持毛母質細胞增殖分化的作用，而毛球部毛母質細胞的增殖分化是毛囊周期性生長調控的關鍵。與其他組織器官的再生一樣，上皮細胞與相應間質細胞間的相互作用在毛囊的周期性生長調控中具有重要意義。

2、 綠茶是一種全世界受到廣泛歡迎的飲料，EGCG是綠茶茶多酚的主要活性成分之一，具有廣泛的生物學活性，已有大量研究表明其具有清除氧自由基抗氧化、抗腫瘤及對紫外線輻射的光保護等作用[1].但EGCG對毛發(fā)生長及毛乳頭細胞增殖的影響國內還未見報道。 低氧誘導因子-1(hypoxia inducible faCtot-1，HIF-1)是1992年由Semenza[2]在Hep3B細胞株中發(fā)現(xiàn)的一種DNA結合蛋白，可調控多種基因的

3、表達。其中HIF-1α是專一調節(jié)O2的HIF-1亞單位，決定了HIF-1的活性，它與靶基因結合，促進其轉錄，使機體產(chǎn)生一系列低氧適應反應?，F(xiàn)已證實HIF有調節(jié)紅細胞生成、鐵代謝、血管形成和葡萄糖代謝等多種作用，同時隨著對HIF-1α研究的進展，發(fā)現(xiàn)其與細胞生長的各種應答機制有密切的關系[3]。 由于毛囊生長的關鍵部位(毛球部)深埋于真皮深層，皮膚表面的局部用藥很難滲透到毛球部，而成纖維細胞緊鄰表皮下方，并包裹在毛囊周圍。我們研究

4、小組前面的研究中已經(jīng)做到將目的基因HIF-1α通過脂質體直接導入成纖維細胞，導入后在毛囊周圍的成纖維細胞表達弄口分泌某些關鍵因子，如VEGF，F(xiàn)GF等，從而發(fā)揮促毛發(fā)生長的作用，達到治療毛發(fā)疾病的目的。作為該課題的一部分，本實驗證明了HIF-1α在毛囊和培養(yǎng)的毛乳頭細胞中的表達，進一步為研究HIF-1α促進毛發(fā)生長的機理提供了理論依據(jù)。 本課題的研究主要包括以下兩部分： (一)EGCG對體外培養(yǎng)的人毛囊和毛乳頭細胞生物學

5、活性的影響顯微分離人毛囊，在加入不同質量濃度EGCG(0～250 mg/L)的WIlliams E培養(yǎng)基中培養(yǎng)，觀察毛囊生長情況；利用兩步酶法分離培養(yǎng)人毛乳頭細胞，加入不同質量濃度的EGCG(0～500 mg/L)，48h后，利用噻唑藍(MTT)法檢測細胞增殖，流式細胞儀檢測細胞周期。結果顯示與空白對照組比較，0.1，1mg/L的EGCG對體外培養(yǎng)的毛囊生長有明顯促進作用(P<0.05)；MTT顯示15.6，31.2，62.5 mg/L

6、的EGCG能夠明顯促進毛乳頭細胞的增殖(P<0.05)；流式細胞儀檢測7.8，15.6，31.2和62.5 mg/LEGCG作用48h后，S期和G2/M期細胞比率明顯增加，G0/G1期細胞比率明顯減少，細胞增殖指數(shù)明顯增加(由5.25％增至5.64％，14.61％，32.51％，37.35％)，細胞增殖指數(shù)與EGCG濃度呈顯著正相關(r=0.933).因此，我們得出結論一定濃度的EGCG能夠促進體外培養(yǎng)的人毛囊生長及人毛乳頭細胞增殖。

7、 (二)HIF-1α人毛囊和毛乳頭細胞中的表達分離完整的人生長期毛囊，提取總RNA，RT-PCR法檢測HIF-1αmRNA的表達。利用兩步酶法分離培養(yǎng)人毛乳頭細胞，取第三代毛乳頭細胞，分為正常培養(yǎng)組和200μM氯化鈷處理組。提取總RNA，RT-PCR法檢測HIF-1αmRNA的表達；提取細胞總蛋白，用Western blot法檢測人毛乳頭細胞中HIF-1α蛋白的表達；用免疫熒光法進一步檢測人毛乳頭細胞中HIF-1α蛋白的表達并定位

8、。RT-PCI濕示人毛囊及分離培養(yǎng)人毛乳頭細胞均表達HIF-1α mRNA。Western blot顯示200μM氯化鈷處理的人毛乳頭細胞表達HIF-1α蛋白，正常培養(yǎng)組未能檢測到HIF-1α蛋白。免疫熒光顯示200μM氯化鈷處理的人毛乳頭細胞胞漿、胞核中均有HIF-1α蛋白的表達，正常培養(yǎng)組未能檢測到HIF-1α蛋白。因此我們可以得出結論人毛囊和毛乳頭細胞均可表達缺氧誘導因子，但常氧下HIF-1α蛋白迅速降解，故免疫熒光、Wester