胰腺干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定.pdf

1、糖尿病是繼心血管疾病、癌癥之后嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的第三大疾病，治療該病常采用的方法有藥物治療、胰島素注射和胰島移植，臨床上大多數(shù)患者常選擇前兩種方法，這主要是因?yàn)檫x用胰島移植雖然能根治糖尿病，但是供體數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足，那么，得到足夠數(shù)量的移植用胰島就顯得尤為重要。研究表明，胰腺干細(xì)胞（Pancreas Stem Cells，PSCs）在體外誘導(dǎo)為胰島樣細(xì)胞團(tuán)，并有胰島素分泌功能，那么，對(duì)于PSCs的體外分離、培養(yǎng)與生物學(xué)特性的研究將為其作為種

2、子細(xì)胞，移植治療糖尿病有著重要意義，所以本研究以新生大鼠和小鼠為材料，進(jìn)行PSCs體外分離、培養(yǎng)與鑒定，并檢測(cè)其胰島素的分泌，初步探討枸杞提取物和枸杞多糖在細(xì)胞水平對(duì)胰腺干細(xì)胞增殖和胰島素分泌的影響，為PSCs作為種子細(xì)胞應(yīng)用于臨床糖尿病的治療提供參考。通過(guò)試驗(yàn)獲得以下結(jié)果：
　　 1． PSCs體外培養(yǎng)體系的篩選
　　 將獲得的原代新生大鼠胰腺源性細(xì)胞以相同細(xì)胞密度分別接種于A(RPMI1640+5%FBS+10 ng

3、/mL EGF+10 ng/mL bFGF)、B(RPMI1640+5%FBS)、C(RPMI1640+10%KSR+10 ng/mL EGF+10 ng/mL bFGF)和D(RPMI1640+5%FBS+等體積的含bFGF、LIF的條件培養(yǎng)液)4種培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀(guān)察發(fā)現(xiàn)，A液中，細(xì)胞大部分呈成纖維生長(zhǎng)，貼壁率達(dá)90%以上，B液中，細(xì)胞的貼壁率只有50%左右，C液中，細(xì)胞貼壁呈集落樣生長(zhǎng)，貼壁率約為10%

4、左右，D液中貼壁率約為30%左右。利用MTT繪制這4種培養(yǎng)液中細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線(xiàn)，其結(jié)果與觀(guān)察到的細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)一致。這表明A液較其它培養(yǎng)液更適合于胰腺源性細(xì)胞在體外的生長(zhǎng)增殖，其后試驗(yàn)將以A液作為PSCs的培養(yǎng)用液。
　　 2．大鼠PSCs的分離、培養(yǎng)與鑒定
　　 利用組織塊法分離新生大鼠胰腺源性細(xì)胞，在A液中進(jìn)行培養(yǎng)、免疫組化分析、誘導(dǎo)為胰島樣細(xì)胞團(tuán)行DTZ染色分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胰腺源性細(xì)胞呈Nestin、PDX-1、GLU

5、T-2染色陽(yáng)性，經(jīng)10 mmol/L NIC誘導(dǎo)4 d后細(xì)胞呈圓形，20 d后細(xì)胞被誘導(dǎo)成胰島樣細(xì)胞團(tuán)，經(jīng)DTZ染色呈陽(yáng)性，并對(duì)其上清進(jìn)行C肽分析，初步試驗(yàn)結(jié)果表明，枸杞子提取物和枸杞多糖對(duì)大鼠PSCs具有促生長(zhǎng)和促胰島素分泌作用。對(duì)其進(jìn)行傳代建系，最高傳至11代。
　　 3．小鼠PSCs的分離、培養(yǎng)與鑒定
　　 利用組織塊法分離新生小鼠胰腺源性細(xì)胞，在A液中進(jìn)行培養(yǎng)、免疫組化分析、誘導(dǎo)為胰島樣細(xì)胞團(tuán)行DTZ染色分析，結(jié)