豬臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定.pdf

1、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(Umbilical cord mesnchymal stem cells，UCMSCs)是一種位于臍帶沃頓氏膠(Wharton's jelly)內(nèi)和血管周?chē)?，?lái)源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層，具有自我更新能力和多分化潛能的一類(lèi)成體干細(xì)胞。
　　 在體外培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞具有分化為三個(gè)胚層細(xì)胞的能力，相對(duì)高量表達(dá)多能性基因Oct-4，sox-2和Nanog；同時(shí)，較低的免疫排斥反應(yīng)使得臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在細(xì)

2、胞替代治療和組織工程方面，成為替代有年齡和疾病限制的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的種子細(xì)胞。
　　 由于其在臨床應(yīng)用上的巨大潛力，關(guān)于人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的研究很多，但多局限于體外實(shí)驗(yàn)，而人的臨床實(shí)驗(yàn)受到限制，因此，在臨床應(yīng)用前尋找一種大動(dòng)物模型成為迫切的需要；但在人以外的其他物種相關(guān)研究報(bào)道匱乏。豬是除靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物外，在生理和解剖結(jié)構(gòu)上與人類(lèi)最相似的動(dòng)物，是一種理想的大動(dòng)物模型，因此其用于基礎(chǔ)理論研究和臨床應(yīng)用研究的潛力巨大。
　　

3、本實(shí)驗(yàn)以新生大白豬的臍帶為實(shí)驗(yàn)材料，比較不同的酶消化法和組織培養(yǎng)法對(duì)豬臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離效果，同時(shí)，添加生長(zhǎng)因子EGF和bFGF，觀察生長(zhǎng)因子對(duì)臍帶間充質(zhì)干增殖速度和生長(zhǎng)狀態(tài)的影響，在此基礎(chǔ)上，確定豬臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)體系，觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)特性。實(shí)驗(yàn)還通過(guò)免疫熒光和PCR方法，在蛋白水平和分子檢測(cè)了細(xì)胞多能性基因Oct-4，sox-2和Nanog的表達(dá)情況，同時(shí)跟蹤了其表達(dá)量的變化及趨勢(shì)。最后，為確定豬臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分化能力，

4、對(duì)體外培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行了成脂和成軟骨的誘導(dǎo)分化。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在原代細(xì)胞的分離培養(yǎng)中，膠原酶Ⅰ和透明質(zhì)酸酶相結(jié)合的酶處理方法更適宜于豬臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離，而通過(guò)沃頓氏膠消化法得到的原代細(xì)胞純度更高，且生長(zhǎng)能力更強(qiáng)；在觀察生長(zhǎng)因子EGF和bFGF對(duì)豬臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞增殖速度和生長(zhǎng)狀態(tài)影響的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)添加EGF和bFGF的細(xì)胞與對(duì)照組相比，無(wú)明顯變化，而兩種因子同時(shí)添加的細(xì)胞在做生長(zhǎng)曲線的檢測(cè)時(shí)，明顯高于對(duì)照組和單獨(dú)

5、添加組別，說(shuō)明EGF和bFGF協(xié)同作用可以促進(jìn)維持細(xì)胞本身的自我更新能力；而后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)傳代培養(yǎng)細(xì)胞在接種6-12h后貼壁，細(xì)胞單層漩渦狀生長(zhǎng)，呈現(xiàn)出典型的成纖維樣，但少量細(xì)胞，呈現(xiàn)出扁平，擴(kuò)張的形態(tài)；細(xì)胞具有一定的增殖能力，目前已有培養(yǎng)至13代的細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)維持成纖維樣，但增殖速度逐漸下降。
　　 在多能性基因的檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，通過(guò)免疫熒光的方法，可以看到多能性基因sox-2，nanog和nestin的表達(dá)，通過(guò)分