高粘附性能乳桿菌的篩選及其對(duì)腸上皮細(xì)胞粘附機(jī)制的初步研究.pdf

1、益生菌是人體腸道內(nèi)正常的生理性有益菌，是腸粘膜生物屏障的主要組成部分，進(jìn)入腸道內(nèi)的益生菌通過粘附定植于腸粘膜表面以保護(hù)腸粘膜上皮細(xì)胞免受各種病原微生物的損傷，所以益生菌在腸道內(nèi)的粘附定植是其發(fā)揮生理作用的前提和基礎(chǔ)，但是，目前對(duì)于益生菌粘附性能的檢測(cè)還沒有一個(gè)合適的實(shí)驗(yàn)方法；而且，益生菌的粘附性能具有菌株特異性，高粘附性能的模式菌株較少，有關(guān)粘附的生物學(xué)保護(hù)作用和粘附機(jī)制等研究尚缺乏系統(tǒng)性資料。因此，本研究通過優(yōu)化體外粘附實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)1

2、1株益生菌的粘附性能進(jìn)行檢測(cè)，篩選得到粘附性能較好的乳桿菌，以該菌株作為研究材料，對(duì)其粘附的生物學(xué)保護(hù)作用進(jìn)行研究，并對(duì)其參與粘附的粘附素分子進(jìn)行初步的提取和鑒定。 方法： (1)以體外培養(yǎng)的腸上皮樣細(xì)胞HT-29為模型，對(duì)影響益生菌體外粘附細(xì)胞的外部因素進(jìn)行了探討，通過優(yōu)化的體外細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)11株益生菌的粘附性能進(jìn)行檢測(cè)，并與放射性同位素標(biāo)記法和粘蛋白的ELISA法進(jìn)行比較。通過制備粘附性能較好菌株的多克隆抗體

3、，采用改進(jìn)的Carnoy固定液對(duì)腸粘膜組織標(biāo)記進(jìn)行固定，然后制備冰凍切片并進(jìn)行免疫組化分析，建立乳桿菌體內(nèi)粘附定植模型。 (2)比較不同粘附性能的菌株對(duì)體外培養(yǎng)的HT-29細(xì)胞的保護(hù)作用。建立抗生素脫污染EPEC感染的小鼠模型，通過腸粘膜病理切片、腸道菌群分析以及細(xì)菌移位分析等，觀察乳桿菌對(duì)腸粘膜屏障的保護(hù)作用。 (3)對(duì)篩選得到的高低粘附力菌株的細(xì)菌表面成分和培養(yǎng)乏液進(jìn)行酶、熱、過碘酸鈉等處理，以觀察細(xì)菌表面成分和培養(yǎng)

4、乏液對(duì)粘附的影響；采用溶菌酶、變?nèi)芫匾约傲蛩徜@等對(duì)細(xì)菌胞壁表面蛋白和培養(yǎng)乏液中的蛋白進(jìn)行提取，通過與HRP標(biāo)記的粘蛋白受體和NHS-Biotin標(biāo)記的HT-29進(jìn)行雜交，對(duì)參與粘附的細(xì)菌胞壁表面蛋白和促粘附因子進(jìn)行初步鑒定；通過制備細(xì)菌的多克隆抗體，篩選與HT-29細(xì)胞粘附的胞壁靶蛋白；并將粘附相關(guān)蛋白進(jìn)行質(zhì)譜分析。 結(jié)果： (1)優(yōu)化了體外粘附評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)方法。pH值、孵育時(shí)間、菌液濃度以及菌的生長狀態(tài)均可影響乳桿菌與H

5、T-29細(xì)胞的粘附。優(yōu)化其基本步驟為：采用培養(yǎng)14天后的腸上皮樣細(xì)胞HT-29，與培養(yǎng)至穩(wěn)定期的菌液濃度為1～2×108/ml益生菌(含益生菌的SCS)，在37℃下共孵育60min，然后用滅菌的PBS洗滌細(xì)胞5次，甲醇固定20min，革蘭氏染色，鏡檢計(jì)數(shù)。 11株益生菌的粘附性能檢測(cè)結(jié)果表明，乳桿菌屬和雙歧桿菌屬的各種間不同菌株在體外對(duì)HT-29細(xì)胞的粘附能力相差很大，其中羅伊氏乳桿菌JCM1081的粘附指數(shù)為495.07±80

6、.03，顯著高于其它益生菌株；嗜酸乳桿菌La1.1878和長雙歧桿菌B050102-14的粘附能力較弱，其粘附指數(shù)分別為135.434±13.93和47.17±5.84；制備了羅伊氏乳桿菌JCM1081的多克隆抗體，免疫組化分析表明，在小鼠腸組織中可見羅伊氏乳桿菌JCM1081在腸粘膜表面呈彌散狀分布、定植，形成腸粘膜菌群生物屏障； (2)粘附性能較好的羅伊氏乳桿菌JCM1081在體外可抑制致病性大腸桿菌對(duì)腸上皮樣細(xì)胞HT-29

7、的粘附(28.1％)(P＜0.01)和侵襲(23.9％)(P＜0.01)，粘附力較弱的嗜酸乳桿菌La1.1878對(duì)致病性大腸桿菌的粘附抑制率為12.4％(P＜0.01)，侵襲抑制率為7.5％(P＜0.01)。抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，嗜酸乳桿菌La1.1878對(duì)EPEC的抑制作用顯著高于羅伊氏乳桿菌JCM1081(p＜0，01)。乳桿菌粘附腸上皮樣細(xì)胞HT-29后，細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，乳酸脫氫酶釋放量和細(xì)胞活力無明顯變化。不顯著影響單層細(xì)胞的通透性和

8、細(xì)胞微絲骨架F-actin。乳桿菌減弱了致病性大腸桿菌對(duì)腸上皮細(xì)胞樣HT-29的損傷(P＜0.05)。小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，灌胃乳桿菌的治療組腸道菌群中雙歧桿菌和乳桿菌的數(shù)量與致病性大腸桿菌感染的模型組相比，有顯著增加(P＜0.05)；在肝、脾、腎等實(shí)質(zhì)器官以及腸系膜淋巴結(jié)處發(fā)現(xiàn)有部分腸桿菌，但數(shù)量明顯低于EPEC感染模型組(P＜0.01)。 (3)羅伊氏乳桿菌JCM1081菌體經(jīng)胰蛋白酶、蛋白酶K處理后，其對(duì)HT-29細(xì)胞的粘

9、附力顯著下降(P＜0.01)；提取了羅伊氏乳桿菌JCM1081細(xì)胞壁表面蛋白，Westernblot結(jié)果顯示29kD和14kD的兩種蛋白與粘蛋白受體和HT-29細(xì)胞的雜交中都出現(xiàn)了強(qiáng)陽性；多抗鑒定結(jié)果顯示，29kD的蛋白與羅伊氏乳桿菌JCM1081的多克隆抗體產(chǎn)生雜交陽性條帶；將29kD的蛋白進(jìn)行質(zhì)譜分析后，結(jié)果表明，此蛋白與羅伊氏乳桿菌ATCC55730的lr0793蛋白的相似性高達(dá)71.1％，實(shí)際分子量為28519.54Da，有26

10、3個(gè)氨基酸，PI為9.78，屬于ATP-BindingCassette蛋白家族。采用相同的方法對(duì)其它8株乳桿菌的胞壁表面蛋白進(jìn)行了鑒定，結(jié)果顯示，其中，只有鼠李糖乳桿菌1.120存在29kD的雜交陽性條帶，而嗜酸乳桿菌L050103-12存在43kD、63kD以及85kD的三種蛋白雜交陽性，在其它乳桿菌中未檢測(cè)出雜交陽性條帶。 將羅伊氏乳桿菌JCM1081的培養(yǎng)乏液用PBS、新鮮的MRS替換，或經(jīng)過胰蛋白酶或蛋白酶K處理，乳桿菌

11、JCM1081對(duì)HT-29的粘附力顯著下降(P＜0.01)；羅伊氏乳桿菌JCM1081的SCS不能促進(jìn)低粘附力菌株嗜酸乳桿菌La1.1878對(duì)HT-29細(xì)胞的粘附；對(duì)JCM1081的SCS進(jìn)行了蛋白提取，經(jīng)初步提純，SDS-PGAE和Westernblot結(jié)果表明，在其SCS中存在一種29kD的小分子蛋白，與HRP標(biāo)記的粘蛋白受體雜交可產(chǎn)生陽性。 結(jié)論： 1.細(xì)胞培養(yǎng)革蘭氏染色法是一種有效的檢測(cè)益生菌粘附性能的實(shí)驗(yàn)方法，

12、它與放射性同位素法、熒光標(biāo)記法以及活菌計(jì)數(shù)法相比較，具有操作簡單，重復(fù)性好，實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定可靠等優(yōu)點(diǎn)。 2.乳桿菌屬和雙歧桿菌屬的各種間不同菌株粘附能力相差很大，篩選了高粘附力菌株羅伊氏乳桿菌JCM1081，為研究乳桿菌的粘附保護(hù)作用及粘附機(jī)制提供了良好模式材料，同時(shí)也提供了一株高粘附性能的益生菌株。 3.高粘附力菌株羅伊氏乳桿菌JCM1081對(duì)HT-29細(xì)胞具有粘附保護(hù)作用，其粘附性能的高低與生物保護(hù)作用的強(qiáng)弱具有一定相

13、關(guān)性。乳桿菌JCM1081可抑制致病性大腸桿菌對(duì)腸上皮樣細(xì)胞HT-29的粘附和侵襲，減弱了致病性大腸桿菌對(duì)腸上皮細(xì)胞樣HT-29的損傷；羅伊氏乳桿菌JCM1081可粘附定植于腸粘膜，形成生物屏障，維持并保護(hù)腸粘膜的正常功能。 4.JCM1081的粘附能力與其細(xì)胞壁表面的蛋白成分密切相關(guān)。分離純化鑒定了其中的一種重要的參與其粘附的新蛋白成分，該蛋白分子量為29kDa，是其主要的粘附素分子之一；29kD蛋白與羅伊氏乳桿菌ATCC55

14、730的Ir0793蛋白相似性高達(dá)71.1％，有263個(gè)氨基酸，PI為9.78，屬于ATP-BindingCassette蛋白家族。其培養(yǎng)乏液中存在有29kD的促粘附因子，與胞壁表面29kD的粘附素蛋白可能為同一類物質(zhì)。該結(jié)果提示29kD蛋白為一種分泌性蛋白，一部分分布于細(xì)胞壁表面，用于識(shí)別細(xì)胞膜表面的粘附素受體，另一部分則分泌至胞外培養(yǎng)乏液中，介導(dǎo)了菌體與細(xì)胞的粘附。29kD的粘附素蛋白在乳桿菌中并不是普遍存在的，不同種屬的乳桿菌，其