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1、眼眶骨折所致的眼眶骨缺損是眼科常見疾病,會(huì)導(dǎo)致不同程度的面中部畸形、眼球位置及視功能異常等。目前常用的眼眶骨缺損的修復(fù)方法是將生物材料連接在骨缺損的兩端,起到支撐眶內(nèi)容物的作用,但多存在感染、排異、移位等并發(fā)癥。本研究聯(lián)合應(yīng)用體外基因治療技術(shù)和組織工程技術(shù),觀察基因增強(qiáng)的組織工程骨對(duì)眶骨缺損的修復(fù)效果。 目的: 將VEGF基因和BMP2基因通過復(fù)制缺陷型腺病毒載體導(dǎo)入骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs),使之能夠穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白
2、,并作為種子細(xì)胞構(gòu)建基因修飾的組織工程化骨,回植動(dòng)物體內(nèi)修復(fù)眶骨缺損。通過增強(qiáng)組織工程化骨的早期血管化和成骨能力,增加體內(nèi)新骨形成量,加快骨缺損修復(fù)和骨愈合的進(jìn)程。 方法: 1.抽取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的骨髓,分離培養(yǎng)BMSCs,用攜帶人VEGF和BMP2基因的腺病毒載體轉(zhuǎn)染BMSCs,以未轉(zhuǎn)染組BMSCs為對(duì)照,進(jìn)行細(xì)胞生物學(xué)及成骨活性檢測(cè),包括:①RT-PCR及熒光定量PCR檢測(cè)目的基因表達(dá)情況;②免疫細(xì)胞化學(xué)及Western-
3、blot檢測(cè)目的蛋白分泌情況;③流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期的改變;④MTT法生長(zhǎng)曲線檢測(cè)細(xì)胞增殖能力;⑤成骨分化能力的檢測(cè)。 2.將分別轉(zhuǎn)染VEGF基因和轉(zhuǎn)染BMP2基因的BMSCs按照10:1,4:1,1:1,1:4,1:10的比例進(jìn)行混合,以等相同數(shù)量的細(xì)胞與等體積的珊瑚支架材料體外復(fù)合培養(yǎng),觀察細(xì)胞在支架上的生長(zhǎng)增殖情況及ELISA檢測(cè)目的蛋白的持續(xù)分泌情況。將細(xì)胞材料復(fù)合體植入裸鼠皮下,分別于植入后2w、4w、8w取材進(jìn)行組
4、織學(xué)檢測(cè),比較其異位成骨能力,篩選出代表最適成骨能力的基因組合比例。 3.制備兔眶下緣12mm長(zhǎng)的節(jié)段性骨缺損模型,分別以自體未轉(zhuǎn)染基因的BMSCs和轉(zhuǎn)染基因的BMSCs構(gòu)建組織工程骨,自體回植修復(fù)骨缺損,以單純材料組和曠置組作為對(duì)照。術(shù)后4w、8w、16w取材,行大體觀察、骨密度檢測(cè)、Micro-CT檢查、組織學(xué)和組織形態(tài)學(xué)的觀察,對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,評(píng)價(jià)基因增強(qiáng)的組織工程骨修復(fù)眶下緣骨缺損效果。 4.在比格犬的眼眶內(nèi)
5、側(cè)壁對(duì)應(yīng)篩竇的位置,制備直徑12mm的圓形眶壁骨缺損模型,分別以自體未轉(zhuǎn)染基因的BMSCs和轉(zhuǎn)染基因的BMSCs構(gòu)建組織工程骨,自體回植修復(fù)骨缺損,以單純材料組和曠置組作為對(duì)照。術(shù)后4w、12w、24w分別取材,進(jìn)行大體觀察、骨密度檢測(cè)、Micro-CT檢查、組織學(xué)及組織學(xué)形態(tài)學(xué)觀察,對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,評(píng)價(jià)基因增強(qiáng)的組織工程骨修復(fù)眼眶壁骨缺損的修復(fù)效果。 結(jié)果: 1.MOI=150時(shí)轉(zhuǎn)染BMSCs,轉(zhuǎn)染效率能達(dá)到95%
6、以上。細(xì)胞轉(zhuǎn)染基因后其生長(zhǎng)周期、增殖能力不受影響,轉(zhuǎn)染后的BMSCs能夠高表達(dá)目的基因和蛋白,其中轉(zhuǎn)染BMP2的細(xì)胞成骨分化能力明顯增強(qiáng)。 2.轉(zhuǎn)基因的BMSCs按照不同比例混合,復(fù)合珊瑚材料植入裸鼠體內(nèi)后的成骨效果明顯不同。2w時(shí)材料內(nèi)部大部分為纖維組織所填充。4w時(shí)開始出現(xiàn)肥大軟骨細(xì)胞,并有少量的類骨質(zhì)形成。8w時(shí)以VEGF:BMP2為1:4組的新生骨量明顯高于其他各組(p<0.05)。轉(zhuǎn)染VEGF組形成的新生血管數(shù)量明顯多
7、于其他各組,但成骨量卻少于轉(zhuǎn)染BMP2組(p<0.05)。 3.12mm長(zhǎng)的兔眶下緣骨缺損在本研究觀察期內(nèi)無1例自行愈合。以轉(zhuǎn)基因的自體BMSCs構(gòu)建的組織工程骨修復(fù)效果各有不同:4w時(shí)BMP2+VEGF組新骨生成速度(4.92±0.36μm/day)明顯高于BMP2組(3.25±0.17μm/day);VEGF組(2.67±0.79μm/day)和未轉(zhuǎn)染基因組(2.33±0.3μm/day)(p<0.05);16w時(shí)BMP2+
8、VEGF組已完全修復(fù)骨缺損,新生骨的密度(618.35±63.54 mgHA/cm3)和與正常骨密度(573.36±26.35mgHA/cm3)無顯著性差別,均明顯高于其他各組(p<0.05)。 4.直徑12mm的圓形犬眶內(nèi)側(cè)壁骨缺損在本研究觀察期內(nèi)無1例自行愈合。4w時(shí),轉(zhuǎn)VEGF組形成的新生血管數(shù)量最多,但成骨量卻明顯少于雙轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染BMP2組。12w時(shí)BMP2+VEGF組和轉(zhuǎn)染BMP2組的成骨速度和新生骨量明顯高于其他組
9、(p<0.05)。24w時(shí)各組的成骨速度和骨組織內(nèi)的血管計(jì)數(shù)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)。BMP2+VEGF組的新生骨體積(95.22±3.19%)接近骨缺損的體積,所形成骨組織的密度(691.15±97.15)與正常骨密度(749.15±67.08)沒有顯著性差異(p>0.05)。 結(jié)論: 1.外源基因VEGF165和BMP2基因?qū)隑MSCs后,BMSCs能夠高表達(dá)目的蛋白。 2.轉(zhuǎn)基因的BMSCs復(fù)合珊瑚
10、材料后,能夠在體外持續(xù)表達(dá)目的蛋白。不同比例的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞構(gòu)建的組織工程骨的體內(nèi)血管生成和成骨能力不同,當(dāng)轉(zhuǎn)VEGF和轉(zhuǎn)BMP2的細(xì)胞比為1:4時(shí)異位成骨的能力最強(qiáng)。 3.兔眶下緣12mm長(zhǎng)的節(jié)段性骨缺損符合標(biāo)準(zhǔn)骨缺損的要求,BMP2+VEGF組的早期血管化和成骨能力均優(yōu)于單基因轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染基因組,16w時(shí)能夠修復(fù)眶下緣骨缺損。 4.犬的眼眶內(nèi)側(cè)壁與篩竇毗鄰,與人類的眼眶結(jié)構(gòu)相似,可作為研究臨床眶壁修復(fù)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。直徑1
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