Nell-1基因轉(zhuǎn)染犬骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的成骨實驗研究.pdf

1、各種原因造成的大段骨缺損的修復(fù)是臨床極為棘手的問題。組織工程（tissue engineering）技術(shù)，特別是基因強(qiáng)化組織工程(gene-enhanced tissueengineering)技術(shù)的出現(xiàn)給人們提供了可能最終解決問題的理想途徑。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（Bone marrow stromal cell, BMSc）目前被認(rèn)為是骨組織工程最有價值的種子細(xì)胞，是目前基因強(qiáng)化組織工程骨常用的靶細(xì)胞。Nell-1（Nel-like,typ

2、e1molecule,Nel 樣I 型分子）作為一種新克隆的成骨基因，具有明顯的成骨作用，其產(chǎn)物蛋白可作為骨組織工程中一種新的生長因子，并且Nell-1 蛋白只作用于顱頜面的成骨細(xì)胞，具有生物學(xué)特異性。目前，將Nell-1基因轉(zhuǎn)染BMSc 應(yīng)用于頜骨組織工程研究，國內(nèi)外尚無相關(guān)報導(dǎo)。在本研究中我們構(gòu)建了含重組人Nell-1 基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體并轉(zhuǎn)染犬BMSc，并對其復(fù)合纖維蛋白膠（Fibers Glue, FG）生物材料后修復(fù)犬下頜骨

3、2.0cm x1.5cmx0.5cm 骨缺損的能力進(jìn)行評價，從而探討建立利用經(jīng)Nell-1 基因轉(zhuǎn)染的BMSc 構(gòu)建組織工程化骨組織的方法。 我們通過（1）構(gòu)建Nell-1 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體（PLNCX2- Nell-1），制備含Nell-1 目的基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒液，感染犬骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，使用原位雜交、RT-PCR以及免疫組織化學(xué)的方法檢測Nell-1 在BMSc中的表達(dá)。（2）采用Rhodamine phalloidin-

4、DAPI熒光染色，定量分析了Nell-1 轉(zhuǎn)染對BMSc細(xì)胞伸展性的影響，采用Jet impingement系統(tǒng)檢測Nell-1 轉(zhuǎn)染對BMSc細(xì)胞粘附性的影響，采用MTT法對比分析經(jīng)轉(zhuǎn)染與未經(jīng)轉(zhuǎn)染BMSc的增殖情況，NPP法檢測細(xì)胞堿性磷酸酶（ALP）合成情況，3H脯氨酸摻入方法檢測膠原合成情況，放射免疫方法測定細(xì)胞骨鈣素（BGP）、層粘連蛋白（LN）合成情況。（3）制備Beagle犬下頜骨2.0cm×1.5 cm×0.5 cm缺損實

5、驗?zāi)Ｐ?，單純病毒液修?fù)實驗分為4 組：PLNCX2-Nell-1+ FG修復(fù)組； PLNCX2+ FG修復(fù)組；單純FG生物材料修復(fù)組；空白組，未加任何填充材料，于術(shù)后采用大體觀察、X線觀察、組織學(xué)觀察方法對骨缺損修復(fù)情況進(jìn)行對比檢測。（4）將制備的病毒液轉(zhuǎn)染BMSc，利用經(jīng)轉(zhuǎn)染的BMSc修復(fù)犬下頜骨2.0cm×1.5 cm×0.5 cm骨缺損。 修復(fù)實驗也分為4 組：經(jīng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞+ FG修復(fù)組；未經(jīng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞+ FG修復(fù)組；

6、 單純FG生物材料修復(fù)組；空白組，未加任何填充材料。采用大體觀察、X線觀察、組織學(xué)觀察、免疫組織化學(xué)等方法對骨缺損修復(fù)情況進(jìn)行對比檢測。 研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)： （1）構(gòu)建的Nell-1 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中外源基因方向、序列均正確、無堿基缺失及突變現(xiàn)象。原位雜交、RT-PCR以及免疫組織化學(xué)檢測顯示經(jīng)PLNCX2- Nell-1 病毒液感染的BMSc中有較強(qiáng)的陽性結(jié)果出現(xiàn)，而PLNCX2空載體轉(zhuǎn)染的BMSc以及未轉(zhuǎn)染的BMSc

7、中極少見陽性表達(dá)結(jié)果。 （2）經(jīng)PLNCX2- Nell-1 病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染的犬BMSc增殖能力無明顯改變，其細(xì)胞伸展面積和細(xì)胞粘附力提高，同時其合成膠原、ALP、BGP、層粘連蛋白的能力能夠得到顯著提高，與PLNCX2病毒液轉(zhuǎn)染、未經(jīng)轉(zhuǎn)染的BMSc相比有顯著性差異。 （3）PLNCX2- Nell-1 重組病毒液與FG生物材料復(fù)合修復(fù)組可見在缺損處有骨性連接形成，組織學(xué)觀察見有大量新生骨組織形成，而PLNCX2

8、病毒液+FG修復(fù)組、單純材料修復(fù)組和空白組組均未見骨性連接形成，僅在部分骨缺損兩斷段形成少量骨組織。 （4）大體觀察、X 線、組織學(xué)檢測分析結(jié)果證實經(jīng)轉(zhuǎn)染的BMSc 修復(fù)骨缺損的成骨速度和成骨量均優(yōu)于未轉(zhuǎn)染BMSc 修復(fù)組，單純FG 生物材料修復(fù)組和空白組中均未見骨缺損得到修復(fù)。 根據(jù)以上結(jié)果，得出以下結(jié)論： （1）采用逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的方法可以將Nell-1 轉(zhuǎn)染至BMSc 中，并有外源Nell-1 的表達(dá)。

9、 （2）PLNCX2- Nell-1 基因轉(zhuǎn)染能夠促進(jìn)體外培養(yǎng)的BMSc向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化，增強(qiáng)其細(xì)胞粘附力，并對其增殖能力沒有顯著影響。 （3）采用PLNCX2- Nell-1 重組病毒液與生物材料復(fù)合的方法能夠修復(fù)犬下頜骨2.0cm×1.5 cm×0.5 cm缺損。 （4）PLNCX2- Nell-1 基因轉(zhuǎn)染能夠提高BMSc形成組織工程化骨組織和修復(fù)骨缺損的能力。 （5）采用Nell-1 基因轉(zhuǎn)