VEGF基因轉(zhuǎn)染骨髓間質(zhì)干細胞的實驗研究.pdf

1、目的：本實驗采用骨髓間質(zhì)干細胞作為基因轉(zhuǎn)染的靶細胞，構建VEGF真核表達質(zhì)粒，利用陽離子脂質(zhì)體將其攜帶導入MSCs中，檢測外源質(zhì)粒在MSCs中的表達，旨在通過基因轉(zhuǎn)染這一途徑將VEGF與MSCs結合起來，從而為探索一種更加有效的缺血性心臟病治療方法提供實驗室基礎。　　方法：將SD大鼠處死，分離四肢長骨，運用直接法分離出其中的骨髓間質(zhì)干細胞，進行培養(yǎng)、傳代、鑒定，傳代細胞分別進入試驗組和對照組。制備SD大鼠急性心梗模型，24小時后，取心

2、臟提取總mRNA，設計大鼠VEGF引物，利用RT-PCR的方法擴增VEGF基因片斷。轉(zhuǎn)化感受肽，連接T載體，進行測序驗證后，將VEGF基因連接于PcDNA3.1質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化Top10感受肽，進行質(zhì)粒擴增。試驗組用構建好的PcDNA3.1-VEGF進行基因轉(zhuǎn)染，陽性對照組用PcDNA3.1空質(zhì)粒進行轉(zhuǎn)染，陰性對照組只加入培養(yǎng)液。用pEGFP綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)染MSCs以分析瞬時轉(zhuǎn)染效率；收集各組第1、3、5、7、9、11天的上清液，用大鼠VEG

3、F的ELISA試劑盒測定培養(yǎng)上清液中VEGF的濃度，各組進行比較，所有數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析；轉(zhuǎn)染細胞用G418進行篩選，兩周后形成穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的菌落，將其進行擴增，提取細胞蛋白，進行Westernblot分析；同時，用MTT法檢測轉(zhuǎn)染后VEGF的表達對MSCs增殖的影響?！　〗Y論：直接法是一種有效、方便、快捷的MSCs分離方法。我們所分離的細胞能傳十代以上，具有干細胞特性以及MSCs的特異性標志陽性，而不表達造血干細胞的特異性標志。陽離子脂