天然衍生脫細佨牛心包膜復合BMP-2基因轉染的骨髓間充質干細胞(BMSCs)引導骨組織再生的實驗研究.pdf

1、引導骨組織再生(Guide bone regeneration，GBR)是近年發(fā)展起來的一項促進組織再生愈合的新理論和新技術。它指利用膜的機械屏障作用，阻止病損區(qū)周圍生長較快的其它組織細胞長入病損區(qū)，消除其它組織細胞的競爭性抑制作用，選擇性引導特定細胞向病損的部位附著、增生，促進病損的修復。近年，種子細胞和生物活性因子的加入，復合化和功能化的GBR膜具有更好的引導骨組織再生作用。
　　目前以天然衍生牛心包為基礎制備復合功能GBR膜

2、的研究較少，本研究分四個部分，首先以天然牛心包為來源通過脫細胞處理和交聯(lián)處理制備出符合引導骨組織再生技術要求的天然衍生GBR膜;第二部分進行骨髓間充質干細胞(BMSCs)不同方向誘導培養(yǎng)和BMP-2基因轉染BMSCs實驗研究，為下一步復合GBR膜的研究打下基礎;第三部分將天然衍生脫細胞牛心包膜與BMP-2基因轉染的BMSCs體外復合，檢測其生物相容性和細胞增殖等情況，為下一步動物實驗打下基礎;第四部進行天然衍生脫細胞牛心包膜復合BMP-

3、2基因轉染的BMSCs引導骨組織再生的初步動物實驗研究，探討脫細胞牛心包膜復合BMP-2基因轉染的BMSCs臨床上引導骨組織再生、修復骨缺損的可行性。
　　第一章：天然衍生脫細胞牛心包膜的制備
　　目的:篩選出一種比較理想的天然衍生牛心包脫細胞處理和交聯(lián)處理方法，為制備出符合臨床要求的GBR膜材料打下基礎。
　　方法:
　　1.天然牛心包膜采用胰酶去垢劑法(Ⅰ)，胰酶核酸酶法(Ⅱ)，胰酶去垢劑核酸酶聯(lián)合法(Ⅲ)，

4、凍融后去污劑法(Ⅳ)，凍融后核酸酶法(Ⅴ)，凍融后去污劑核酸酶聯(lián)合法(Ⅵ)進行脫細胞處理，通過光鏡、掃描電鏡觀察，細胞毒性實驗，機械性能測定，細胞趨化性實驗等，篩選出最佳脫細胞處理方法。
　　2.天然衍生脫細胞牛心包膜采用戊二醛和京尼平對其進行交聯(lián)處理，通過光鏡、掃描電鏡觀察，厚度檢測，機械性能檢測，交聯(lián)指數(shù)測定，體外降解以及細胞毒性試驗等，篩選出最理想脫細胞牛心包膜交聯(lián)方法。
　　結果:
　　1.脫細胞結果表明:凍融

5、去污劑核酸酶聯(lián)合法處理后牛心包纖維排列致密有序，天然結構保存良好，細胞毒性低，是最理想的脫細胞方法。
　　2.交聯(lián)結果表明:京尼平交聯(lián)脫細胞牛心包膜比戊二醛交聯(lián)效果具有更好生物相容性，交聯(lián)效果好，是最理想的交聯(lián)方法。
　　結論:凍融去污劑核酸酶聯(lián)合法是制備脫細胞牛心包膜最理想的方法;京尼平交聯(lián)的脫細胞牛心包膜具有更好生物相容性。
　　第二章：骨髓間充質干細胞(BMSCs)多向誘導培養(yǎng)及BMP-2基因轉染BMSCs實驗研

6、究
　　目的:探索兔骨髓間充質干細胞(BMSCs)的分離培養(yǎng)方法并對BMSCs誘導，觀察其多向培養(yǎng)潛能;進行BMP-2基因轉染BMSCs實驗，為GBR復合膜研究打下基礎。
　　方法:
　　1.貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)兔BMSCs，相差顯微鏡觀察BMSCs的生長增殖情況;取生長狀態(tài)良好的第2代BMSCs，分別用成骨、成脂、成軟骨誘導培養(yǎng)基對其進行誘導培養(yǎng)，然后檢測BMSCs多向培養(yǎng)生長情況。
　　2.傳代培養(yǎng)良好的BMS

7、Cs，通過質粒載體，采用電穿孔法轉染BMP-2基因，然后進行下列鑒定:熒光顯微鏡觀察BMP-2轉染BMSCs生長增殖情況;RT-PCR檢測轉染細胞的BMP-2 mRNA表達;Westeblot檢測BMP-2在蛋白水平的表達;ALP檢測評價其成骨分化能力。
　　結果:
　　1.兔原代及傳代BMSCs細胞生長良好;成骨誘導實驗ALP染色結果陽性，茜素紅染色陽性;成脂誘導實驗油紅O染色結果陽性;成軟骨誘導實驗Ⅰ型膠原和Aggrec

8、an免疫化學染色陽性。
　　2.BMP-2轉染BMSCs的轉染效率為41.2±1.1％; RT-PCR結果表明BMP-2 RNA表達陽性，Westernblot結果表明轉染BMSCs可有效表達轉染基因;BMP-2轉染的BMSCs的ALP活性明顯高于空白轉染組。
　　結論:
　　1.原代培養(yǎng)兔BMSCs具有多向生長能力，可成功誘導培養(yǎng)為脂肪細胞、軟骨細胞、成骨細胞。
　　2.BMP-2基因可有效成功轉染BMSCs，

9、從而為下步復合GBR膜研究打下基礎。
　　第三章：脫細胞牛心包膜復合BMP-2轉染的BMSCs引導骨再生的體外實驗研究
　　目的:探討脫細胞牛心包復合BMP-2基因轉染的BMSCs材料的生物相容性，細胞毒性及BMSCs在牛心包膜材料上的貼附、生長、增殖及成骨分化情況。
　　方法:脫細胞牛心包膜體外復合BMP-2轉染的BMSCs，通過掃描電鏡評估細胞在脫細胞牛心包支架材料上的的貼附、生長與增殖情況，MTT檢測膜材料對轉染

10、細胞的細胞毒性，ELISA檢測BMP-2含量，結晶紫染色法測定BMSCs細胞粘附能力檢測， ALP活性實驗檢測轉染BMSCs成骨性能。
　　結果:
　　1.掃描電鏡結果表明:脫細胞牛心包復合BMP-2基因轉染的BMSCs后，細胞能良好的貼附并增殖。
　　2.細胞毒性檢測結果表明，各組細胞的存活率沒有明顯差異。
　　3.細胞粘附能力檢測結果表明:脫細胞牛心包膜增強了BMP-2轉染BMSCs細胞粘附能力。
　　

11、4.ALP活性檢測、Westernblot檢測和RT-PCR檢測結果表明:脫細胞牛心包膜增強了BMP-2轉染BMSCs向成骨細胞轉化的能力。
　　結論:脫細胞牛心包復合BMP-2基因轉染的BMSCs功能膜有良好的生物相容性和細胞相容性，可能具備更佳的引導骨再生能力。
　　第四章：脫細胞牛心包膜復合BMP-2轉染的BMSCs引導骨再生的動物實驗研究
　　目的:將脫細胞牛心包復合BMP-2基因轉染的BMSCs構建的功能膜植

12、入兔下頜骨骨缺損處，探討其引導骨組織再生情況。
　　方法:建立兔下頜骨骨缺損模型，分別植入BMP-2轉染的BMSCs/脫細胞牛心包復合體（A組）、單純脫細胞牛心包材料（B組），同時設立空白對照（C組），分別于術后第4、8、12周行大體肉眼觀察，X線檢測和組織形態(tài)學檢測，觀察其成骨情況。
　　結果:大體肉眼觀察、X線檢測、組織形態(tài)學檢測結果表明:術后第8周及第16周實驗組A，B組骨缺損愈合情況與C組（空白對照）有顯著差異，且A