VEGF基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植于梗死心肌組織的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、該研究共分三部分論述:第一部分:大鼠MSCs的體外分離、培養(yǎng)、增殖和向心肌樣細(xì)胞的誘導(dǎo)分化.目的:建立MSCs的體外分離培養(yǎng)方法,研究MSCs的生物學(xué)特征并通過(guò)用5-氮胞苷(5-azacytidine,5-aza)體外誘導(dǎo)其向心肌樣細(xì)胞分化.方法:1.無(wú)菌條件下獲取SD大鼠的骨髓,采用貼壁法進(jìn)行分離培養(yǎng)和傳代增殖.相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化,計(jì)算MSCs的貼壁率和繪制生長(zhǎng)曲線.并用流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)CD29、CD45的表達(dá),進(jìn)行細(xì)胞成

2、份鑒定.2.用5-氮胞苷體外誘導(dǎo)MSCs,觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu),免疫組化檢測(cè)肌鈣蛋白T(cTnT),結(jié)蛋白(Desmin)和RT-PCR檢測(cè)心肌特異因子基因(β-肌球蛋白重鏈,β-MHC)的表達(dá).結(jié)論:采用貼壁篩選法,簡(jiǎn)便易行,短期內(nèi)可獲得大量的純度較高的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞;在5-氮胞苷的誘導(dǎo)下,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞有向心肌樣細(xì)胞分化的趨勢(shì).第二部分:腺病毒介導(dǎo)的VEGF基因體外轉(zhuǎn)染MSCs的研究.目的:探討攜帶VEGF基因的腺病毒載體轉(zhuǎn)染MSCs

3、的效率,以及轉(zhuǎn)染VEGF基因?qū)SCs增殖分化的影響.方法: 用貼壁法分離培養(yǎng)MSCs后,用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果和轉(zhuǎn)染率,用免疫組化、Western-Blot和ELISA方法分別檢測(cè)VEGF基因轉(zhuǎn)染MSCs后VEGF的表達(dá)情況.結(jié)論:腺病毒介導(dǎo)的VEGF基因可以安全、有效的轉(zhuǎn)染MSCs,MSCs是一種理想的基因載體細(xì)胞,其攜帶的VEGF基因可獲得較高的表達(dá)水平.第三部分:腺病毒介導(dǎo)的VEGF基因(Ad.VEGF)轉(zhuǎn)染大鼠M

4、SCs移植于梗死心肌的實(shí)驗(yàn)研究.目的:探討Ad.VEGF轉(zhuǎn)染的MSCs移植入大鼠梗死心肌組織后的轉(zhuǎn)歸,并評(píng)價(jià)其對(duì)心功能的影響和對(duì)血管新生的作用.方法:選取相同基因背景的SD雄性大鼠為研究對(duì)象,共40只,體重250~300g.通過(guò)左側(cè)開胸縫扎左冠狀動(dòng)脈前降支,建立心梗模型.體外培養(yǎng)擴(kuò)增大鼠MSCs后以5-aza誘導(dǎo)和溴脫氧嘧啶(Bromodeoxyuridine,BrdU)標(biāo)記.動(dòng)物分組:A組(MSCs/Ad.VEGF組):注射體外轉(zhuǎn)染A

5、d.VEGF的MSCs 4×10<'6>/50μl,n=10;B組(MSCs組):注射MSCs 4×10<'6>/50μl,n=10;C組(Ad.VEGF組):注射Ad.VEGF 5×10<'7>pfu/50μl,n=10;D組(對(duì)照組):注射無(wú)血清IMDM培養(yǎng)液50μl,n=10.移植前及移植后2周、4周分別用超聲檢測(cè)心功能.細(xì)胞移植后進(jìn)行組織病理學(xué)檢查和cTnT、Ⅷ因子免疫組化檢測(cè),觀察細(xì)胞存活分化和血管新生情況.結(jié)論:移植于梗死心