燙傷大鼠骨骼肌AMPK的活化對(duì)蛋白分解的作用及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制.pdf

1、目的：嚴(yán)重?zé)齻蠊趋兰〉鞍状x以高分解代謝和負(fù)氮平衡為特點(diǎn)，我所以往研究發(fā)現(xiàn)泛素蛋白酶體途徑是骨骼肌蛋白分解的主要機(jī)制，其中肌肉萎縮盒F蛋白（MAFbx）和肌肉特異性環(huán)指蛋白1（MuRF1）是骨骼肌蛋白分解的關(guān)鍵酶，胰島素能夠抑制骨骼肌蛋白分解。但目前對(duì)于燒傷后骨骼肌MAFbx和MuRF1表達(dá)變化及其調(diào)節(jié)機(jī)制的研究尚不完善。
　　 已知泛素蛋白酶體參與的蛋白分解過程需要ATP提供能量，骨骼肌的能量狀態(tài)可能影響著蛋白分解代謝。單磷

2、酸腺苷激活的蛋白激酶（AMPK）是調(diào)節(jié)三磷酸腺苷（ATP）生成的關(guān)鍵分子，近年來又發(fā)現(xiàn)AMPK的活化抑制蛋白合成，然而，迄今為止對(duì)于骨骼肌能量狀態(tài)及AMPK對(duì)骨骼肌蛋白分解代謝影響和機(jī)制的報(bào)道甚少。為進(jìn)一步闡明燒傷后骨骼肌蛋白分解代謝的機(jī)制，指導(dǎo)臨床治療，本課題試圖通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)探討：（1）燙傷大鼠骨骼肌蛋白分解、能荷和AMPK的變化；（2）燙傷大鼠血清對(duì)L6肌管蛋白分解、能荷和AMPK的影響：（3）L6肌管AMPK對(duì)蛋白分

3、解的調(diào)節(jié)作用，及其與胰島素信號(hào)通路相互作用的機(jī)制。
　　 方法：1.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：雄性Wistar大鼠100只（180～220g），隨機(jī)分為兩組：（1）對(duì)照組（n=50）；（2）燙傷組（n=50），背部置于94℃熱水12s致30％總體表面積（TBSA）Ⅲ度燙傷。分別于傷后6h、1d、3d、5d和7d（n=10）麻醉處死大鼠，解剖分離雙側(cè)脛骨前肌、趾長伸?。‥DL）和比目魚肌。實(shí)驗(yàn)過程中每日稱量體重，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)稱量肌肉重量。Weste

4、rn blotting檢測(cè)脛骨前肌AMPK表達(dá)和活性，實(shí)時(shí)定量PCR（Q-PCR）檢測(cè)脛骨前肌AMPKα、絲氨酸/蘇氨酸激酶11（LKB1）、MAFbx及MuR目的mRNA表達(dá)水平，高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定脛骨前肌核苷酸水平，計(jì)算AMP（單磷酸腺苷）/ATP比值和細(xì)胞能荷（EC）。
　　 2.細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)A：采用上述燙傷動(dòng)物模型，雄性Wistar大鼠40只（200～250g），隨機(jī)分為兩組：對(duì)照組（n=20）和燙傷組（n=

5、20），傷后12h無菌抽取大鼠腹主動(dòng)脈血液，制備血清。10％胎牛血清（FBS）預(yù)處理低血清分化的L6肌管12h后，分別采用含10％假傷大鼠血清的DMEM（10％SS組）、或含10％燙傷大鼠血清的DMEM（10％BS組）孵育肌管不同時(shí)間（0、10min、1h、6h、24h）。L6肌管蛋白、mRNA和核苷酸水平的測(cè)定同方法1。
　　 3.細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)B：低血清分化的L6肌管于無血清DMEM中預(yù)處理12h后，分別于不同濃度或不同時(shí)間條

6、件下，用含AMPK活化劑（AICAR，5-咪唑-4-酰胺-1-β-D-呋喃糖核苷）或含胰島素的DMEM處理L6肌管，部分實(shí)驗(yàn)中采用P13K抑制劑（wortmannin）、Akt抑制劑（Akt Inhibitor IV）或AMPK抑制劑（Compound C）預(yù)處理肌管1h。Western blotting檢測(cè)L6肌管AMPK、Akt、糖原合成酶激酶（GSK）3-β和乙酰輔酶A羧化酶（ACC）的表達(dá)及其活性，mRNA和核苷酸水平的檢測(cè)同方

7、法1。
　　 結(jié)果：1.（1）大鼠燙傷后體重較對(duì)照組下降，于傷后3d最為顯著（p<0.05）。大鼠EDL重量和EDL重量/體重比值于傷后1～3d顯著低于對(duì)照組（p<0.01）。（2）與對(duì)照組比較，燙傷后6h脛骨前肌MAFbx mRNA表達(dá)明顯上調(diào)（p<0.01），燙傷后6h和1d，脛骨前肌MuRF1 mRNA表達(dá)明顯上調(diào)（p<0.01），于5d和7d明顯下降（p<0.01或p<0.05）。（3）燙傷后6h，大鼠脛骨前肌AMPKα

8、（Thr172）磷酸化水平高于對(duì)照組（p<0.05），其后逐漸下降，于3d顯著低于對(duì)照組（p<0.01），以后又升高。燙傷對(duì)脛骨前肌AMPKα蛋白表達(dá)無影響（p>0.05）。（4）燙傷后1d，AMPKα2mRNA表達(dá)明顯低于對(duì)照組（p<0.01）。（5）燙傷后6h，LKB1 mRNA水平較對(duì)照組上調(diào)（p<0.01），其后下降，于3d和5d明顯低于對(duì)照組（p<0.01），7d有所回升。（6）燙傷后6h、1d、5d和7d，AMP/ATP比值

9、較對(duì)照組升高（p<0.01），而EC較對(duì)照組降低（p<0.01或p<0.05）。
　　 2.（1）燙傷大鼠血清孵育L6肌管24h顯著上調(diào)MAFbx和MuR目的mRNA表達(dá)（p<0.05）。（2）與10％SS組比較，10％BS組L6肌管AMPKα蛋白表達(dá)顯著下降（30min、1h、6h，p<0.01），而AMPKa磷酸化水平升高（1h、6h，p<0.05；24h，p<0.01）。（3）10％BS組L6肌管AMPKα1 mRNA表達(dá)

10、于24h較10％SS組降低（p<0.01），AMPKα2 mRNA表達(dá)于1h、6h和24h均較10％SS組降低（p<0.05）。（4）10％BS組L6肌管LKB1 mRNA表達(dá)于24h較10％SS組升高（p<0.01），然而，燙傷大鼠血清對(duì)L6肌管AMP/ATP比值和EC無影響（p>0.05）。
　　 3.（1）AMPK活化劑AICAR以劑量依賴方式抑制MAFbx和MuRF1 mRNA表達(dá)，Compound C預(yù)處理可抑制AIC

11、AR對(duì)MuRF1基因表達(dá)的上調(diào)作用（p<0.01）。（2）AICAR以劑量依賴方式上調(diào)Akt（Ser473）和GSK3-β（Ser9）的磷酸化水平，與激活PI3K有關(guān)。（3）胰島素以劑量依賴的方式下調(diào)MAFbx和MuRF1 mRNA表達(dá)，AICAR能夠逆轉(zhuǎn)胰島素對(duì)MAFbx和MuRF1 mRNA表達(dá)的抑制作用（p<0.01）。（4）胰島素以劑量依賴方式去磷酸化抑制AMPK，其機(jī)制為通過激活A(yù)kt實(shí)現(xiàn)。（5）胰島素以劑量依賴方式抑制肌管L

12、KB1 mRNA表達(dá)，而對(duì)AME/ArP和EC無顯著影響（p>0.05）。
　　 結(jié)論：燙傷大鼠骨骼肌能量狀態(tài)的下降激活A(yù)MPK，AMPK的活化上調(diào)骨骼肌泛素E3連接酶的基因表達(dá)，蛋白分解增強(qiáng)。AMPK與蛋白代謝密切相關(guān)的胰島素信號(hào)通路相互作用，AMPK激活A(yù)kt，而胰島素抑制AMPK，胰島素下調(diào)蛋白分解代謝的可能機(jī)制之一為抑制AMPK。因此，燙傷后骨骼肌AMPK的活化可促進(jìn)蛋白分解代謝，針對(duì)AMPK的治療措施可能是抑制燒傷后蛋