嚴(yán)重燙傷大鼠骨骼肌消耗的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激機(jī)制及胰島素治療的作用.pdf

1、目的：高分解代謝是嚴(yán)重?zé)齻蟠x的顯著特點，表現(xiàn)為明顯的骨骼肌消耗，嚴(yán)重影響患者預(yù)后。我們前期研究發(fā)現(xiàn)泛素-蛋白酶體介導(dǎo)的蛋白降解及骨骼肌細(xì)胞凋亡是燒傷后骨骼肌消耗的主要機(jī)制，胰島素治療能夠抑制上述過程。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmicreticulum，ER)是蛋白質(zhì)合成和修飾的重要場所，也是負(fù)責(zé)鈣離子儲存的細(xì)胞器，其穩(wěn)態(tài)對細(xì)胞的功能和生存至關(guān)重要。如果內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)失衡，將導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)（endoplasmicreticulumstr

2、ess，ERS），后者廣泛參與機(jī)體的代謝、炎癥、腫瘤發(fā)生等過程，其介導(dǎo)的凋亡通路也是真核細(xì)胞重要的凋亡途徑之一。為進(jìn)一步闡明嚴(yán)重?zé)齻蠊趋兰∠牡臋C(jī)制，指導(dǎo)臨床治療，本課題擬通過三部分研究：（1）觀察嚴(yán)重燙傷大鼠骨骼肌ERS活化、胰島素信號通路、細(xì)胞凋亡及骨骼肌消耗改變；（2）ERS的治療性藥物4-苯基丁酸（4-phenylbutyricacid，4-PBA）干預(yù)嚴(yán)重燙傷大鼠骨骼肌ERS活化，觀察胰島素信號通路、細(xì)胞凋亡及骨骼肌消耗改變

3、；（3）觀察胰島素治療對嚴(yán)重燙傷大鼠骨骼肌ERS活化、胰島素信號通路、細(xì)胞凋亡及骨骼肌消耗的影響，以探討嚴(yán)重燙傷后ERS在骨骼肌消耗中的作用，明確胰島素治療對嚴(yán)重燙傷后ERS和骨骼肌消耗的影響，進(jìn)一步豐富嚴(yán)重?zé)齻蠊趋兰∠募耙葝u素治療作用的分子機(jī)制。
　　方法：（1）雄性Wistar大鼠64只，隨機(jī)分為對照組（n=32）和燙傷組（n=32）。燙傷組大鼠背部制備30％體表面積（totalbodysurfaceaera，TBSA）Ⅲ

4、°燙傷；對照組制備假傷模型。實驗過程中監(jiān)測體重變化，分別于傷后1d、4d、7d、14d（n=8）麻醉處死大鼠，分離獲取脛骨前肌和比目魚肌，稱量肌肉重量。透射電鏡觀察脛骨前肌超微結(jié)構(gòu)變化，免疫組織化學(xué)法檢測脛骨前肌和比目魚肌半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）-3表達(dá)，原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記（TUNEL）法測定骨骼肌細(xì)胞凋亡，Westernblotting檢測脛骨前肌和比目魚肌ERS不同通路中葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucoseregula

5、tedprotein78,GRP78)、C/EBP同源蛋白(C/EBP-homologousprotein,CHOP)、Caspase-12及脛骨前肌中胰島素信號通路中磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol3kinase，PI3K）蛋白表達(dá)變化情況。
　?。?）雄性Wistar大鼠16只，隨機(jī)分為燙傷組（n=8）和治療組（n=8）。所有大鼠背部制備30%TBSAⅢ°燙傷。治療組大鼠從傷后1d起給予4-PBA[溶

6、于0.6%羧甲基纖維素鈉（Carboxymethylcellulose-Na，CMC-Na）中]治療（700mg/kg·d，灌胃），燙傷組大鼠給予等量CMC-Na治療。傷后14d麻醉處死大鼠，分離獲取脛骨前肌和比目魚肌，稱量體重及肌肉重量。其余指標(biāo)觀察同前。
　　（3）雄性Wistar大鼠48只，隨機(jī)分為燙傷組（n=24）和治療組（n=24）。所有大鼠背部制備30%TBSAⅢ°燙傷。治療組大鼠從傷后1d起給予甘精胰島素注射液（溶于

7、生理鹽水中）治療（1IU/kg·d，皮下注射），至傷后7d。燙傷組大鼠給予等量生理鹽水治療，至傷后7d。實驗過程中監(jiān)測體重及血糖變化，分別于傷后4d、7d、14d（n=8）麻醉處死大鼠，分離獲取脛骨前肌和比目魚肌，稱量肌肉重量。其余指標(biāo)觀察同前。
　　結(jié)果：（1）在相同時間點和對照組相比，嚴(yán)重燙傷大鼠傷后4d、7d、14d體重明顯減輕（P<0.01）；脛骨前肌重量及其與體重比值在傷后各時間點均明顯下降（P<0.01）；比目魚肌重量

8、在傷后7d、14d有明顯下降（P<0.01）。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)燙傷后大鼠脛骨前肌部分細(xì)胞核有明顯的凋亡改變，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯擴(kuò)張。傷后各時間點燙傷大鼠脛骨前肌及比目魚肌細(xì)胞凋亡增加（P<0.05），同時伴有脛骨前肌及比目魚肌Caspase-3表達(dá)增多（P<0.01）。燙傷后大鼠脛骨前肌GRP78蛋白表達(dá)傷后4d明顯升高（P<0.01），傷后4d、7d比目魚肌GRP78蛋白表達(dá)升高（P<0.05）。傷后4d、14d燙傷大鼠脛骨前肌Caspase

9、-12活性體表達(dá)升高（P<0.05），比目魚肌在傷后1d、4dCaspase-12活性體表達(dá)升高（P<0.05）。脛骨前肌CHOP表達(dá)在傷后各時間點均增加（P<0.01），比目魚肌在傷后1d、4d、7dCHOP表達(dá)增高（P<0.05）。傷后7d、14d大鼠脛骨前肌磷酸化PI3K表達(dá)明顯降低（P<0.05）。
　?。?）4-PBA治療大鼠傷后7d體重較燙傷組增加（P<0.01），體重減輕趨勢有所緩解。傷后14d4-PBA治療大鼠脛骨

10、前肌重量明顯增加（P<0.05），但其與體重比值無明顯改變（P>0.05）。治療組比目魚肌重量及其與體重的比值無明顯變化（P>0.05）。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)4-PBA治療后骨骼肌細(xì)胞凋亡改變減輕，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張得到抑制。同時，治療組大鼠脛骨前肌及比目魚肌細(xì)胞凋亡減少（P<0.01），Caspase-3表達(dá)也明顯減少（P<0.01）。傷后14d，4-PBA治療組大鼠脛骨前肌及比目魚肌GRP78、Caspase-12活性體、CHOP蛋白表達(dá)均較燙

11、傷組明顯減少（P<0.05），脛骨前肌磷酸化PI3K表達(dá)明顯增加（P<0.01）。
　?。?）傷后14d胰島素治療組大鼠體重較同時間點燙傷組增加（P<0.05），同時脛骨前肌重量也有明顯增加（P<0.01）。胰島素治療期間，治療組血糖明顯低于同時間點燙傷組（P<0.01）。同時，胰島素治療可減輕骨骼肌細(xì)胞凋亡改變，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張。傷后4d、7d、14d胰島素治療大鼠脛骨前肌細(xì)胞凋亡減少（P<0.01）；傷后7d、14d比目魚肌細(xì)胞

12、凋亡減少（P<0.01），兩者都伴有Caspase-3表達(dá)減少（P<0.05）。傷后4d、7d、14d，胰島素治療大鼠脛骨前肌及比目魚肌GRP78表達(dá)增加（P<0.05）。傷后7d、14d治療組大鼠脛骨前肌及比目魚肌Caspase-12活性體表達(dá)較燙傷組明顯減少（P<0.01）。傷后4d、7d、14d治療組大鼠脛骨前肌CHOP表達(dá)均明顯降低（P<0.01），傷后7d、14d治療組大鼠比目魚肌CHOP表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.0