AMPK對腫瘤細胞中TGF-β信號轉(zhuǎn)導及功能的抑制作用.pdf

1、背景:腫瘤已成為人類健康的主要威脅，腫瘤的危害主要來自腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移。腫瘤干細胞（CSC）是腫瘤轉(zhuǎn)移的種子細胞，能夠在全新組織環(huán)境定植、生存、繁殖。間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是腫瘤細胞侵潤、轉(zhuǎn)移的啟始步驟，也是已分化腫瘤細胞重獲自我更新、繁殖分化潛能等干細胞特性的途徑。因此，EMT/CSC被認為是腫瘤轉(zhuǎn)移、耐藥和復發(fā)的根源。轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）作為 EMT的重要誘導因子，與腫瘤轉(zhuǎn)移、血管新生、病理分期、病人預后密切相關。多種固體腫瘤

2、中，TGF-β過量表達，并伴有下游分子表達或活性升高，活躍的 TGF-β信號促進了中晚期腫瘤的發(fā)展。Bmi-1是TGF-β信號的下游靶分子之一，參與EMT和CSC自我更新的主要癌基因，與腫瘤的惡性程度、浸潤轉(zhuǎn)移及療效預后都有密切關系。眾多科學家相信通過調(diào)控 TGF-β/Smad信號通路的活性和抑制 Bmi-1蛋白表達有助于抑制EMT/CSC，發(fā)揮抑癌功能。
　　代謝重組是決定腫瘤細胞存活的重要因素。流行病學資料表明，肥胖、糖尿病等

3、代謝性疾病患者發(fā)生腫瘤的風險明顯高于其它人群，而二甲雙胍等降糖藥物的應用有助降低腫瘤發(fā)生風險。多項研究表明，以二甲雙胍為代表的AMPK激活劑（AICAR、苯乙雙胍、A769962）具有抑制腫瘤細胞的增殖和遷移能力；并且AMPK主要上游激酶LKB1對惡性腫瘤轉(zhuǎn)移也有明顯的抑制作用，而且多種腫瘤組織的AMPK-Thr172磷酸化明顯低于癌旁或正常組織。
　　AMPK的抑癌功能是公認的，激活AMPK能夠增強能量瓶頸和細胞周期檢查點對腫瘤

4、過度增殖的限制功能，抑制增殖，促進凋亡。因此，基因突變（如LKB1的突變）和腫瘤組織微環(huán)境改變所導致的 AMPK活性下降成為腫瘤發(fā)展的重要原因。但目前關于AMPK對腫瘤轉(zhuǎn)移、EMT的抑制機制尚未能深入研究，本研究探討了 TGF-β信號的過度活躍是否與 AMPK活性下降有關，以及激活AMPK能否抑制TGF-β信號轉(zhuǎn)導、EMT、Bmi-1表達等熱點問題，對于腫瘤治療有重要意義。
　　目的:探討LKB1/AMPK對TGF-β信號轉(zhuǎn)導、E

5、MT、Bmi-1表達及細胞遷移等生物行為的抑制作用。
　　材料與方法:
　　1、細胞株包括：胃癌細胞AGS，SGC-7901，肺癌細胞A549細胞，肺上皮細胞BEAS-2B，MEF，MDA-MB-231，NMuMG，MCF10A。
　　2、以shRNA敲除LKB1，或以慢病毒導入LKB1基因，構(gòu)建LKB1表達不同的細胞株，給予二甲雙胍等AMPK激活劑預處理，再用TGF-β1刺激，然后以免疫印跡技術檢測AMPK磷酸化、S

6、mad磷酸化以及EMT標志物的變化。
　　3、將 AMPK顯性失活的突變體和顯性活化的突變體轉(zhuǎn)入細胞后，檢測AMPK磷酸化、Smad磷酸化以及EMT標志物的變化。
　　4、以Q-PCR檢測LKB1、AMPK化學激活劑對TGF-β下游靶基因mRNA表達的影響。
　　5、以細胞劃痕或Transwell技術檢測細胞遷移速率，分析激活AMPK對細胞遷移的影響。
　　6、收集糖尿病人血清，分為服用二甲雙胍和未服用患者；收集

7、小鼠服用二甲雙胍前后的血清。以ELISA技術檢測人和小鼠血清TGF-β水平。
　　7、以熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測激活 AMPK對 TGF-β1轉(zhuǎn)錄水平，Smad轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能的影響。
　　結(jié)果:
　　一、AMPK對TGF-β表達的抑制作用
　　通過螢光素酶報告基因分析發(fā)現(xiàn)二甲雙胍、苯乙雙胍處理后，TGF-β轉(zhuǎn)錄活性下降了50％；以ELISA分析人血清TGF-β1水平，結(jié)果表明服用二甲雙胍患者的TGF-β1水平低于未

8、服用者，但結(jié)果無統(tǒng)計學差異，可能受病例不足影響；進一步動物實驗，發(fā)現(xiàn)小鼠服用二甲雙胍后血中TGF-β1水平明顯低于服用前；以上結(jié)果提示，激活AMPK對TGF-β生成有抑制作用。
　　二、LKB1/AMPK對TGF-β誘導Smad磷酸化的抑制作用
　　激活AMPK導致TGF-β信號轉(zhuǎn)導抑制。乳腺癌細胞MCF10A和肺腺癌細胞A549LKB1中，給予二甲雙胍激活AMPK可以減弱Smad2/3磷酸化水平；另外，將AMPK持續(xù)激活突

9、變體轉(zhuǎn)入A549細胞，AMPK磷酸化增強， Smad2/3磷酸化減弱。在LKB1表達缺乏細胞（如A549細胞和MDA-MB-231細胞）中轉(zhuǎn)入LKB1基因，提高LKB1表達可以減弱TGF-β誘導Smad磷酸化，結(jié)果提示LKB1參與了AMPK對TGF-β信號轉(zhuǎn)導的抑制作用。
　　AMPK失活致使TGF-β信號轉(zhuǎn)導增強。以顯性失活AMPK?1突變體抑制C4-2細胞內(nèi)源性AMPK、敲除MEF細胞中的AMPKα1和α2基因，或以shRNA

10、敲除乳腺癌細胞MCF10A中LKB1和AMPKα1等途徑阻止AMPK活化后， TGF-β1誘導的Smad2/3磷酸化均明顯增強。
　　三、LKB1/AMPK對TGF-β誘導細胞遷移的抑制作用
　　LKB1/AMPK對細胞遷移的抑制作用，在細胞劃痕和Transwell實驗中，TGF-β刺激能促進A549細胞、NuMG細胞、AGS細胞的遷移速率，而AMPK激活劑二甲雙胍和A769962對此有明顯抑制作用，而且LKB1的表達可以增

11、強這種抑制作用。抑制AMPK活性致使細胞遷移速率明顯加快，通過顯性失活AMPK?1突變體抑制C4-2細胞內(nèi)源性AMPK活性后，細胞遷移明顯加快，而以多西環(huán)素恢復AMPK功能又可以抑制細胞遷移。另外，以shRNA敲除BEAS-2B細胞的LKB1后，細胞遷移速率明顯增加。
　　四、LKB1/AMPK對TGF-β誘導EMT的抑制作用
　　A549細胞中，經(jīng)TGF-β1長時間刺激后，上皮細胞特征的標志物E-cadherin表達下降，

12、間質(zhì)細胞特征性標志物N-cadherin和Slug表達上升；同時給予苯乙雙胍和TGF-β1能抑制TGF-β1誘導EMT變化，引起E-cadherin表達水平增加， N-cadherin和Slug水平下降。乳腺上皮細胞NMuMG細胞，受TGF-β1因子刺激后，細胞形態(tài)向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)變，伴有E-cadherin表達下降，而N-cadherin，β-catenin， vimentin和Slug表達增加；二甲雙胍或AICAR能減弱TGF-β所誘導

13、NMuMG細胞的間質(zhì)細胞特征，逆轉(zhuǎn)以上反應。在胃癌細胞AGS中，TGF-β信號轉(zhuǎn)導受二甲雙胍激活AMPK的抑制后， E-cadherin逐漸增強，而N-cadherin、β-catenin、Vimentin等標志物逐漸減弱，呈時間依賴性。
　　五、LKB1/AMPK對TGF-β靶基因表達的調(diào)控作用
　　Q-PCR檢測表明：二甲雙胍對PAI-1、FN、CTGF、IL-6等4種TGF-β靶基因的表達水平無明顯影響，而TGF-β能

14、誘導PAI-1、FN、CTGF、IL-6等4基因的表達。但是，二甲雙胍對 TGF-β誘導基因表達有抑制作用，而且該抑制作用在LKB1高表達的細胞中更加明顯。
　　六、LKB1/AMPK對Bmi-1基因表達的抑制作用
　　二甲雙胍刺激A549細胞引起p-AMPK-Thr172表達升高，同時使Bmi-1的表達下降。LKB1高表達的細胞中， Bmi-1表達減弱，而LKB1低表達的細胞則Bmi-1表達更高。胃癌細胞SGC-7901和