Follistatin對(duì)鴨骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖的影響及其作用機(jī)制的初步研究.pdf_第1頁(yè)
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文檔簡(jiǎn)介

1、Follistatin作為TGF-β超家族的一個(gè)成員,在哺乳動(dòng)物胚胎期骨骼肌及其生長(zhǎng)發(fā)育的過程中發(fā)揮著廣泛的生理作用,在骨骼肌細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)肝功能、誘導(dǎo)紅細(xì)胞再生、神經(jīng)細(xì)胞分化等多種信號(hào)調(diào)節(jié)通路中也發(fā)揮著重要作用。因此,探索Follistatin對(duì)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖的影響,同時(shí)期望探索Follistatin對(duì)鴨骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖的作用機(jī)制,希望為深入研究Follistatin調(diào)控鴨骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育的作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)。
  本實(shí)驗(yàn)以孵

2、化14d的鴨胚為試驗(yàn)材料,采用差速貼壁的方法分離培養(yǎng)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞,使用濃度分別為0、1、10、100ng/ml的Follistatin處理鴨骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞,在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36h后,采用CCK-8檢測(cè)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖情況,使用抗pax7抗體染色,DAPI染核,鑒定骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞;使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞周期變化情況;采用real-time qPCR方法檢測(cè)Follistatin對(duì)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖過程中的標(biāo)記基因PCNA,基因

3、MyoD以及TGF-β信號(hào)通路中TGF-β、Smad2和Smad3的表達(dá)的影響;Western blot檢測(cè)Smad2和Smad3蛋白表達(dá)及其磷酸化水平,確定Follistatin對(duì)鴨骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖影響及其作用機(jī)制。主要結(jié)果如下:
  1.通過使用Pax7抗體進(jìn)行免疫熒光染色,結(jié)果顯示有95%以上的Pax7呈陽(yáng)性表達(dá),說明培養(yǎng)的細(xì)胞為骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞。
  2.通過CCK-8檢測(cè)不同濃度Follistatin(0、1、1

4、0、100ng/ml)對(duì)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖的影響,結(jié)果表明10ng/ml的Follistatin對(duì)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖效果最明顯(P<0.01)。
  3.采用Pax7進(jìn)行免疫熒光染色顯示,與對(duì)照組相比,Pax7陽(yáng)性表達(dá)顯著升高(P<0.05)。流式檢測(cè)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞周期變化結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,細(xì)胞G1期顯著降低(P<0.05),而G2期和S期顯著升高(P<0.05)。real-time qPCR方法檢測(cè)PCNA、MyoD基因的

5、表達(dá)情況,與對(duì)照組相比,結(jié)果顯示PCNA基因表達(dá)量顯著升高(P<0.01),MyoD基因表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。通過使用real-time qPCR方法檢測(cè)TGF-β、 Smad2和Smad3基因的表達(dá)量,與對(duì)照組相比,結(jié)果表明TGF-β、Smad2和Smad3基因的表達(dá)量都顯著升高(P<0.01)。 Western blot檢測(cè)結(jié)果表明Smad2和Smad3的蛋白表達(dá)及其磷酸化水平顯著升高(P<0.05)。
  4.使用

6、LY2109761抑制劑處理鴨骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞后,采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞周期的變化情況,結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,LY(LY2109761)抑制劑處理組中,細(xì)胞G1期顯著升高(P<0.05),細(xì)胞S期和G2期顯著降低(P<0.05)。Realtime qPCR檢測(cè)MyoD、PCNA、TGF-β、Smad2和Smad3基因的表達(dá)情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)MyoD基因和PCNA基因分別呈現(xiàn)顯著上升和下降(P<0.05),TGF-β基因表達(dá)量沒有顯

7、著變化,Smad2、Smad3基因的表達(dá)量顯著降低(P<0.05),LY2109761抑制劑和Follistatin共同處理鴨骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞后,細(xì)胞G1期顯著升高(P<0.05),細(xì)胞S期和G2期顯著降低(P<0.05)。MyoD基因和PCNA基因分別呈現(xiàn)顯著上升和下降(P<0.05),TGF-β基因表達(dá)量顯著升高(P<0.05),Smad2、Smad3基因的表達(dá)量顯著降低(P<0.05),Western blot檢測(cè)Smad2、Sma

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