NLS-RARα相互作用蛋白的篩選與驗證.pdf

1、目的：構(gòu)建維甲酸受體變異蛋白(NLS-RARα)的誘餌表達載體，為應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選與NLS-RARα相互作用的蛋白建立實驗基礎(chǔ)；利用酵母雙雜交技術(shù)篩選與NLS-RARα相互作用的蛋白質(zhì)，為研究NLS-RARα的作用靶點及其生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。 方法：PCR擴增NLS-RARα，克隆入誘餌載體pGBKT7中，將構(gòu)建好的誘餌載體pGBKT7-NLS-RARα轉(zhuǎn)化到酵母細胞AH109中，并利用蛋白印跡法分析誘餌蛋白的表達情況。同

2、時檢測誘餌蛋白有無毒性，滲漏和自激活作用；構(gòu)建能在哺乳動物細胞表達的載體pCMV-HA-NLS-RARα和pCMV-Myc-JTVl，經(jīng)酶切鑒定正確后，共轉(zhuǎn)染入HEK293細胞，利用免疫共沉淀技術(shù)驗證它們之間的相互作用。 結(jié)果：成功擴增了NLS-RARα基因片斷，并克隆入pGBKT7中，測序結(jié)果正確。誘餌載體成功轉(zhuǎn)化到酵母細胞AH109中，誘餌蛋白無毒性，無自激活和滲漏，Western Blotting分析證實酵母細胞表達誘餌蛋

3、白；構(gòu)建的重組表達載體pCMV-HA-NLS-RARα和pCMV-Myc-JTVl經(jīng)酶切鑒定成功，轉(zhuǎn)染HEK293細胞后，用抗HA多克隆抗體沉淀后，用抗Myc單克隆抗體檢測，能檢測到JTVl的表達。 結(jié)論：成功構(gòu)建了NLS-RARα結(jié)合域的酵母誘餌表達載體，為進一步篩選與之相互作用的蛋白奠定了基礎(chǔ)；成功構(gòu)建了pCMV-HA-NLS-RARα和pCMV-Myc-JTVl，在HEK293細胞表達后利用免疫共沉淀驗證實了NLS-RAR