毛白楊木質(zhì)部特異啟動子結(jié)構(gòu)與功能研究.pdf

1、毛白楊(Populus tomentosa Carr.)是我國速生樹種之一，廣泛用于園林綠化、建筑、造紙等行業(yè)。隨著人工林面積的擴增，基因型越來越為單一。以天牛為主的蛀干害蟲的危害越來越嚴重，造成了重大的經(jīng)濟損失，其防治問題也顯得愈為突出和愈加重要。林木抗蟲基因工程以其安全、高效、無污染等諸多優(yōu)點成為人們的研究熱點。鑒于目前針對鞘翅目害蟲的抗蟲基因工程研究普遍存在對天牛類害蟲抗蟲效果不明顯的問題，通過啟動子策略，融合抗鞘翅目基因，提高抗

2、蟲基因在其危害部位的表達水平，具有重要的理論和應(yīng)用價值。
　　本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，采用缺失分析法，對毛白楊木質(zhì)部特異啟動子MDCesAP5'端連續(xù)缺失片段與報告基因構(gòu)建成融合基因，轉(zhuǎn)化受體后檢測GUS及GFP報告基因的表達模式，從而確定該啟動子與組織特異性相關(guān)的關(guān)鍵調(diào)控域。同時，通過對轉(zhuǎn)化毛白楊木質(zhì)部特異啟動子的煙草進行4℃低溫處理、創(chuàng)傷處理及茉莉酸甲酯(MeJA)、水楊酸(SA)、脫落酸(ABA)激素誘導(dǎo)處理，定量檢測不同

3、器官的GUS酶表達活性，來分析啟動子對各個誘導(dǎo)因子誘導(dǎo)的反應(yīng)情況。通過對毛白楊木質(zhì)部特異啟動子結(jié)構(gòu)與功能的深入研究，可確定決定木質(zhì)部特異性或誘導(dǎo)活性的調(diào)控元件，利用其調(diào)控外源基因在蛀干害蟲寄主植物中表達，不但避免抗蟲基因?qū)θ梭w或非目標生物的傷害，提高抗蟲效果，減少耐受性昆蟲的發(fā)展，而且對于木材質(zhì)量調(diào)控基因工程的研究具有重要的理論和實踐意義。
　　主要研究結(jié)果如下:
　　(1)克隆出距離MDCesAP轉(zhuǎn)錄起始位點不同長度的5'

4、端缺失的啟動子片段，分別與GUS基因和GFP基因融合，構(gòu)建成含有GUS基因的植物表達載體pMU2-121、pMU4-121和含有GFP基因的植物表達載體pMU2-1302、pMU3-1302、pMU4-1302、pMU5-1302。
　　(2)將構(gòu)建好的含有GUS基因的植物表達載體pMU2-121、pMU4-121，分別轉(zhuǎn)入煙草中獲得相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因植株。通過瞬時表達和穩(wěn)定表達的GUS染色結(jié)果表明，MU2、 MU4均具有啟動子功能。通

5、過GUS酶活性定量檢測表明，MU2(-611～0 bp)、MU4(-312～0 bp)具有木質(zhì)部組織特異啟動子活性，而且MU4活性高于MU2。從序列分析結(jié)果看，與啟動子組織特異性相關(guān)的GGTATG存在于-147～-142 bp處，很可能是決定MU2、MU4具有木質(zhì)部組織特異性的必要元件。另外，雖然MU4相對于MU2缺少了-611～-313 bp序列，但活性反而大幅度增加，說明在此序列范圍內(nèi)，存在抑制啟動子活性的元件。
　　(3)將

6、構(gòu)建好的含有缺失片段融合GFP基因的植物表達載體pMU2-1302、pMU3-1302、pMU4-1302、pMU5-1302，分別轉(zhuǎn)入煙草中獲得相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因植株。通過熒光檢測結(jié)果表明BU2(-611～0 bp)、BU3(-493～0 bp)、BU4（-312～0 bp）及BU5(-133～0bp)均能夠不同程度驅(qū)動GFP基因在植株中表達，按啟動子活性強弱順序依次為BU5、BU4、BU2、BU3。根據(jù)木質(zhì)部組織特異性強弱順序依次排列為B

7、U4、BU5、BU2、BU3。BU5及BU2表現(xiàn)出組成型啟動子的特點。從序列分析結(jié)果看，在BU2相對于MDCesAP全長啟動子片段缺少的-610～-794 bp序列間存在決定啟動子活性及特異性的關(guān)鍵序列。前期研究中通過生物信息學分析表明在此序列間發(fā)現(xiàn)了與基因轉(zhuǎn)錄活性的正調(diào)控有關(guān)的富含A/T的序列以及對核心啟動子的強度和確定真正的起始位點必要的INR的共同序列是YAYTCYYY;另外在此序列間的MYB元件對決定啟動子的木質(zhì)部組織特異性具有

8、重要作用。通過BU3活性最低，而BU4活性增強這一結(jié)果表明，在BU4相對于BU3所缺少的-493～-311 bp序列間，含有抑制啟動子活性的重要元件。根據(jù)BU4具有明顯的木質(zhì)部組織特異性，而BU5表現(xiàn)出組成型啟動子的特點這一結(jié)果，表明BU5相對于BU4所缺少的-312～-134 bp序列間存在決定啟動子木質(zhì)部組織特異性的關(guān)鍵序列。這一結(jié)果與前期生物信息學分析在BU4序列內(nèi)存在決定啟動子的韌皮部組織特異性的GGTATG這一特征基序的結(jié)果是

9、吻合的。
　　(4)以融合pA1121的轉(zhuǎn)基因煙草作為實驗材料，將其根、莖、葉分別進行4℃低溫處理、創(chuàng)傷處理及茉莉酸甲酯(MeJA)、水楊酸(SA)、脫落酸(ABA)激素誘導(dǎo)處理，定量檢測不同器官的GUS酶表達活性，結(jié)果表明MDCesAP啟動子在創(chuàng)傷處理后，仍然具有木質(zhì)部組織特異性，且具有傷害誘導(dǎo)活性。在低溫處理后，降低了木質(zhì)部組織特異性，葉部表現(xiàn)出低溫誘導(dǎo)活性。MDCesAP啟動子對ABA具有一定的誘導(dǎo)活性，但組織特異性從木質(zhì)部

10、轉(zhuǎn)入葉部。在MeJA激素誘導(dǎo)后，仍然具有明顯的木質(zhì)部組織特異性，并表現(xiàn)出誘導(dǎo)活性。在SA激素誘導(dǎo)后，仍然具有明顯的木質(zhì)部組織特異性，并表現(xiàn)出誘導(dǎo)活性。綜上所述，MDCesAP木質(zhì)部特異性啟動子在傷害、MeJA和SA兩種激素刺激下木質(zhì)部組織特異性沒有變化且都表現(xiàn)出誘導(dǎo)活性;但在低溫及ABA條件刺激下，組織特異性從木質(zhì)部轉(zhuǎn)移至葉部。由此表明MDCesAP同時具有組織特異性和誘導(dǎo)型啟動子的特征。而且不同條件的刺激，可以改變啟動子的組織特異性。