楊樹木質(zhì)部特異性啟動(dòng)子的功能及JCesAP關(guān)鍵調(diào)控域研究.pdf

1、楊樹是我國的主要樹種之一，具有生長迅速、適應(yīng)性強(qiáng)、易雜交、易改良等優(yōu)良特性。隨著園林綠化事業(yè)的發(fā)展，楊樹在我國環(huán)境建設(shè)中也發(fā)揮著愈加重要的作用。但由于天牛類蛀干害蟲嚴(yán)重危害楊樹，而且采用傳統(tǒng)防治技術(shù)難以見效且污染環(huán)境，所以利用植物基因工程技術(shù)防治天牛類蛀干害蟲成為有效解決這一問題的有效措施。
　　本研究將前期從楊樹中分離到的啟動(dòng)子融合報(bào)告基因的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化楊樹及煙草，通過對(duì)轉(zhuǎn)基因植物中不同組織、器官GUS報(bào)告基因的定量活性檢測(cè)

2、，從而篩選具有木質(zhì)部組織特異性啟動(dòng)子。通過定量檢測(cè)創(chuàng)傷及ABA激素刺激條件下，轉(zhuǎn)基因楊樹不同器官的GUS酶活性，來分析不同啟動(dòng)子對(duì)創(chuàng)傷及ABA激素誘導(dǎo)的響應(yīng)情況。并采用5'端缺失分析方法，對(duì)前期從加楊中分離得到的木質(zhì)部特異啟動(dòng)子JCesAP，利用模式植物作為轉(zhuǎn)基因體系，分析啟動(dòng)子不同區(qū)段驅(qū)動(dòng)GUS基因在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)能力和水平。明確各調(diào)控元件的結(jié)構(gòu)與功能及相互之間的關(guān)系、確定控制木質(zhì)部組織特異性及誘導(dǎo)活性的調(diào)控元件。主要研究結(jié)果如下

3、:
　　(1)采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得含有三個(gè)植物表達(dá)載體PMDCesAP-GUS、PJCesAP-GUS、PDMDCesAP-GUS的轉(zhuǎn)基因植株。GUS組織化學(xué)染色結(jié)果表明，植物材料葉脈、葉肉都顯示藍(lán)色，說明MDCesAP、JCesAP、DMDCesAP都具有啟動(dòng)子活性。而且MDCesAP葉脈與葉肉比較顯示明顯的深藍(lán)色，說明具有明顯的木質(zhì)部組織特異性。通過GUS定量活性檢測(cè)結(jié)果表明:MDCesAP是3個(gè)啟動(dòng)子中功能最強(qiáng)的，且具有木質(zhì)

4、部組織特異性;與葉、莖比較，串聯(lián)改造后的DMDCesAP啟動(dòng)子在根部組織特異性最高;與根、莖比較，JCesAP啟動(dòng)子在葉部組織特異性最高。
　　(2)以融合PMDCesAP-GUS、PJCesAP-GUS、PDMDCesAP-GUS的轉(zhuǎn)基因楊樹作為實(shí)驗(yàn)材料，分別對(duì)其根、莖、葉進(jìn)行創(chuàng)傷及ABA(脫落酸Abscisie Acid)激素誘導(dǎo)處理，通過定量檢測(cè)轉(zhuǎn)基因楊樹不同器官的GUS酶活性，來分析不同啟動(dòng)子對(duì)創(chuàng)傷及ABA激素誘導(dǎo)的響應(yīng)情

5、況。結(jié)果表明，創(chuàng)傷處理轉(zhuǎn)基因楊樹12h時(shí)，PMDCesAP的根的GUS酶活達(dá)到最高點(diǎn)。ABA激素處理轉(zhuǎn)基因楊樹，PDMDCesAP、PJCesAP在根中的GUS酶活是先升高、降低、升高再降低的趨勢(shì)，處理0h時(shí)PDMDCesAP的GUS酶活最高;PMDCesAP的根、莖在ABA激素處理前GUS酶活處于最大值。
　　(3)以融合PMDCesAP-GUS、PJCesAP-GUS、PDMDCesAP-GUS的轉(zhuǎn)基因煙草作為實(shí)驗(yàn)材料，分別對(duì)

6、其根、莖、葉進(jìn)行創(chuàng)傷及ABA激素誘導(dǎo)處理，通過定量檢測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草不同器官的GUS酶活性，來分析不同啟動(dòng)子對(duì)創(chuàng)傷及ABA激素誘導(dǎo)的響應(yīng)情況。結(jié)果表明，創(chuàng)傷處理轉(zhuǎn)基因煙草24h時(shí)，PJCesAP的根的GUS酶活達(dá)到最高點(diǎn)。ABA激素處理轉(zhuǎn)基因煙草，PMDCesAP在根中的GUS酶活是降低、升高、降低、升高的變化規(guī)律;PJCesAP在根、葉中的GUS酶活是先升高再降低的變化規(guī)律;PDMDCesAP的根在ABA激素處理前GUS酶活處于最大值。<

7、br>　　((4)將GUS作為報(bào)告基因，構(gòu)建了JCesAP啟動(dòng)子的一系列植物缺失表達(dá)載體，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化模式植物的方法對(duì)啟動(dòng)子的缺失片段活性進(jìn)行分析。采用瞬時(shí)檢測(cè)功能分析結(jié)果表明，L2、 L3和L4三個(gè)啟動(dòng)子缺失片段均具有啟動(dòng)予功能。在得到的穩(wěn)定表達(dá)的轉(zhuǎn)基因煙草植株中，經(jīng)過GUS組織化學(xué)染色可知，L2葉片表面有明顯的藍(lán)色區(qū)域，L3和L4需要在顯微鏡下仔細(xì)觀察方能看出藍(lán)色，不太明顯，表明L2、L3和L4啟動(dòng)子都具有啟動(dòng)子活性，L2的