HMGB1對人角膜緣上皮細胞生物學效應的研究.pdf

1、角膜炎癥是眼科最常見的疾病之一，而復雜的細胞因子網(wǎng)絡在角膜炎癥中發(fā)揮了重要的調控作用。因此，關于細胞因子的研究對揭示角膜炎癥的發(fā)病機制，尋找新的治療干預靶點具有非常重要的意義。高遷移率族蛋白1(HMGB1)作為一種晚期炎癥介質，它既是炎癥的早期啟動者(HMGB1從壞死細胞的被動釋放)，又是炎癥晚期的促進者(巨噬細胞主動分泌HMGB1)，然而，目前我們尚未發(fā)現(xiàn)HMGB1在眼表疾病的相關研究。此外，胞外HMGB1需與相應胞膜受體結合才能發(fā)揮

2、其生物學效應。HMGB1已知的受體包括晚期糖基化終產(chǎn)物受體(RAGE)、TOLL樣受體(TLR)2及4，其中TLR2和TLR4受體在角膜上皮細胞的表達已有報道，但目前尚無角膜上皮細胞表達RAGE受體的相關研究。因此，本實驗的目的在于探討角膜緣上皮細胞是否存在RAGE受體的表達，及HMGB1是否對角膜緣上皮細胞存在生物學效應。
　　 本研究首先建立人角膜緣上皮細胞的體外培養(yǎng)方法，探討角膜緣上皮細胞是否存在RAGE受體的表達。我們收

3、集了角膜移植術后的角鞏膜環(huán)，分別使用CnT20和DMEM全培養(yǎng)基，采用組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)角膜緣上皮細胞，并對第三代細胞采用免疫熒光法進行AE5的鑒定。然后通過免疫熒光法和RT-PCR技術對正常角膜組織的冰凍切片和培養(yǎng)細胞進行RAGE受體表達的檢測。我們發(fā)現(xiàn)與DMEM全培養(yǎng)基相比，CnT20無血清培養(yǎng)基更有利于角膜緣上皮細胞的體外培養(yǎng)。并且，CnT20無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的第三代角膜緣上皮細胞存在角蛋白3的表達，證實了培養(yǎng)的細胞為角膜上皮細胞來

4、源，因此可以用于本實驗的后續(xù)研究。同時，免疫熒光和RT-PCR技術驗證角膜緣上皮細胞有RAGE受體的陽性表達，主要在細胞膜上表達，為HMGB1對角膜緣上皮細胞存在生物學效應的猜想提供生物學基礎。
　　 然后，本研究從細胞增殖、凋亡、遷移三方面研究HMGB1對角膜緣上皮細胞的生物學效應。我們采用CCK8法檢測HMGB1對角膜緣上皮細胞增殖的影響；采用流式細胞儀、共聚焦熒光顯微鏡檢測HMGB1對角膜緣上皮細胞凋亡的影響；采用劃痕實驗

5、探討HMGB1對角膜緣上皮細胞遷移的影響。結果發(fā)現(xiàn)HMGB1對角膜緣上皮的增殖和遷移存在雙向調節(jié)作用，即低濃度時表現(xiàn)為促進作用，而高濃度時表現(xiàn)為抑制作用。此外，HMGB1對角膜緣上皮的凋亡存在明顯的促進作用。上述結果表明高濃度的HMGB1能抑制角膜緣上皮細胞的增殖和遷移，并促進細胞的凋亡，因此不利于角膜上皮的修復，延緩角膜上皮的愈合，可導致炎癥的遷延不愈。
　　 最后，本研究探討了HMGB1對角膜緣上皮細胞細胞因子表達的影響。通

6、過免疫熒光和ELISA技術，我們初步發(fā)現(xiàn)HMGB1可以促進VEGF、NFkappaB、TNF-α、IL-1β的表達，促進NFkappaB的核轉位。這說明HMGB1可能通過調控炎癥因子和促新生血管因子的表達而參與角膜炎癥的發(fā)生發(fā)展，因此有可能是干預角膜炎癥的一個治療靶點。
　　 綜上所述，本研究首次驗證了角膜緣上皮細胞存在RAGE受體的表達，并發(fā)現(xiàn)HMGB1參與了角膜緣上皮細胞的增殖、凋亡、移行及細胞因子分泌的調節(jié)。本研究揭示了H