白介素10通過(guò)巨噬細(xì)胞極化作用減輕磨損顆粒誘導(dǎo)的炎癥和骨溶解.pdf

1、本文分為兩個(gè)部分進(jìn)行探討：
　　第一部分 IL-10極化巨噬細(xì)胞的體外研究
　　目的：
　　體外研究觀察IL-10極化在磨損顆粒刺激骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞中的作用:
　　1.確定IL-10極化巨噬細(xì)胞的理想用量。
　　2.觀察IL-10對(duì)磨損顆粒刺激的骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞的基因表達(dá)的影響。
　　3.觀察IL-10對(duì)磨損顆粒刺激的骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞的蛋白表達(dá)的影響。
　　材料和方法：
　　1.將R

2、AW264.7細(xì)胞種入六孔板中（2×105個(gè)/孔），4-6小時(shí)后細(xì)胞貼壁，加入IL-10進(jìn)行刺激，細(xì)胞分為三組:不加IL-10（對(duì)照組）;加入10μg IL-10;加入20μg IL-10。加入IL-10進(jìn)行刺激后48小時(shí)收集細(xì)胞提取蛋白。Western blot方法檢測(cè)STAT3和磷酸化STAT3的表達(dá)。
　　2.原代骨髓起源的巨噬細(xì)胞的分離與培養(yǎng)
　　CO2氣體法處死Sprague Dawley大鼠，75％酒精中浸泡3次

3、，每次10分鐘。分離大鼠股骨和脛骨，用注射器和DMEM完全型培養(yǎng)基將骨髓細(xì)胞沖入50ml無(wú)菌離心管中，用細(xì)胞過(guò)濾器過(guò)濾細(xì)胞并離心，接著加入4攝氏度預(yù)冷的紅細(xì)胞裂解液裂解30分鐘，裂解紅細(xì)胞完成后，用1×PBS清洗細(xì)胞2次，用70％DMEM完全培養(yǎng)基和30％L929細(xì)胞培養(yǎng)上清重懸細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。過(guò)夜后將未貼壁的細(xì)胞丟棄。
　　3.將骨髓起源的巨噬細(xì)胞種入12孔盤中（5×105個(gè)/孔），待細(xì)胞貼壁后，將其分為三組:第一組不加任何刺激（

4、陰性對(duì)照組）;第二組加入2mg PMMA顆粒（陽(yáng)性對(duì)照組）;第三組加入2mg PMMA顆粒和20ng IL-10（處理組）。細(xì)胞刺激5天后收集細(xì)胞提取總RNA進(jìn)行基因表達(dá)檢測(cè)。RT-PCR法檢測(cè)IL-1β、CD80、MHCⅡ、CD163、IL-10、TGF-β1和CCR2基因表達(dá)的變化。
　　4.將5×103個(gè)細(xì)胞種入8孔chamber slide里，待細(xì)胞貼壁后，將細(xì)胞隨機(jī)分為三組:第一組不加任何刺激（陰性對(duì)照組）;第二組加入2

5、mg PMMA顆粒（陽(yáng)性對(duì)照組）;第三組加入2mg PMMA顆粒和20ngIL-10(處理組)。刺激一周后進(jìn)行細(xì)胞免疫化學(xué)染色，檢測(cè)iNOS和CD163的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1.Western blot法檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞經(jīng)過(guò)不同濃度IL-10刺激后總的STAT3和磷酸化的STAT3表達(dá)情況。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，經(jīng)過(guò)IL-10刺激的RAW264.7表達(dá)總的STAT3沒(méi)有變化，但是磷酸化的STAT3的表達(dá)隨著IL-10

6、濃度的增加表達(dá)逐漸增強(qiáng)。
　　2.實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法檢測(cè)經(jīng)過(guò)PMMA顆?；騊MMA顆粒與IL-10共同刺激的骨髓起源的巨噬細(xì)胞中IL-1β、CD80、MHCⅡ、CD163、IL-10、TGF-β1和CCR2基因表達(dá)的變化。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明PMMA顆粒刺激組能夠誘導(dǎo)骨髓起源的巨噬細(xì)胞IL-1β、CD80和MHCⅡ的基因表達(dá)。經(jīng)過(guò)IL-10處理的組能夠減少PMMA顆粒刺激骨髓起源的巨噬細(xì)胞中IL-1β的基因表達(dá)(p＜0.01)。而其

7、他的M1標(biāo)記物:CD80、MHCⅡ的基因表達(dá)沒(méi)有明顯的變化。同時(shí)，IL-10處理組能明顯的增加骨髓起源的巨噬細(xì)胞中CD163、IL-10、TGF-β1和CCR2的基因表達(dá)(p＜0.01)。
　　3.細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色用于檢測(cè)特異性M1標(biāo)記物iNOS和M2標(biāo)記物CD163的表達(dá)。細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色顯示PMMA顆粒能夠顯著誘導(dǎo)iNOS的表達(dá)(p＜0.001)。IL-10處理組能明顯抑制PMMA顆粒誘導(dǎo)iNOS表達(dá)的作用。IL-10

8、處理組還可以明顯促進(jìn)骨髓起源的巨噬細(xì)胞表達(dá)CD163(p＜0.001)。
　　結(jié)論：
　　1.20ng IL-10是理想的實(shí)驗(yàn)研究用量。
　　2.IL-10可以促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞的基因表達(dá)。
　　3.IL-10能夠促進(jìn)PMMA顆粒刺激的骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞分化為M2型巨噬細(xì)胞并且減少PMMA顆粒刺激的骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞的分化為M1巨噬細(xì)胞。
　　第二部分 IL-10通過(guò)極化巨噬細(xì)胞減輕磨損顆粒誘導(dǎo)的骨溶解

9、r>　　目的：
　　1.建立模仿假體松動(dòng)的air pouch動(dòng)物模型。
　　2.觀察IL-10能否改善磨損顆粒引起的骨溶解。
　　3.探討IL-10減輕磨損顆粒引起的骨溶解的具體機(jī)制。
　　材料和方法：
　　1.建立實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型
　　剔除Balb/c小鼠背部毛發(fā)露出背部部分，用碘伏消毒背部皮膚，用5毫升注射器皮下注射3毫升過(guò)濾過(guò)的無(wú)菌空氣在皮下形成一個(gè)空氣囊泡。每隔一天向空氣囊泡中注射一次空氣以維持空

10、氣囊泡形態(tài)。6天后，通過(guò)手術(shù)方法從供體小鼠得到一部分股骨（約0.5厘米）或一部分頭蓋骨（約0.6厘米×0.3厘米）并手術(shù)置入空氣囊泡中。24小時(shí)后，所有小鼠分為三組（每組8只）:第一組只注射200μl PBS(陰性對(duì)照組);第二組注射200μlUHMWPE顆粒（2毫克）（陽(yáng)性對(duì)照組）;第三組注射200μl UHMWPE顆粒并且20ngIL-10溶解其中（處理組）。IL-10或PBS每隔一天補(bǔ)注射一次。
　　2.Micro CT掃描

11、
　　在手術(shù)置入股骨或頭蓋骨24后和處死小鼠之前分別進(jìn)行Micro CT掃描。掃描參數(shù)設(shè)置為:30μm isotropic voxel size;400 projections;200 ms exposure time;70 kW voltage and114μA current。用Micro CT分析軟件進(jìn)行三維圖像的重建和骨密度分析。用骨體積與總體積的比值分析總的骨質(zhì)丟失情況。
　　3.組織病理學(xué)檢測(cè)
　　從第一次

12、注射IL-10開始開始記錄，七天后處死所有實(shí)驗(yàn)小鼠，收集股骨或頭蓋骨及其周圍完整的炎性反應(yīng)膜。一部分炎性膜凍存于負(fù)80攝氏度低溫冰箱中用于實(shí)時(shí)定量RT-PCR和western blot分析STAT1、NF-κ3p65、JNK1、STAT3、SHIP、STAT6和PPAR-γ的基因或蛋白表達(dá)水平。頭蓋骨和炎性反應(yīng)膜包埋于冰凍切片包埋液中凍存于負(fù)80攝氏度低溫冰箱，制備冰凍切片，用于檢測(cè)TRAP陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量。股骨和炎性反應(yīng)膜用10％的福爾

13、馬林固定液固定，用10％EDTA溶液脫鈣一周后制備石蠟切片。H&E染色用于觀察不同組別之間的炎性反應(yīng)膜的厚度以及細(xì)胞的浸潤(rùn)情況。免疫組織化學(xué)染色用于檢測(cè)iNOS或CD163的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1.炎性反應(yīng)膜的特征
　　UHMWPE顆粒誘發(fā)了明顯的局部炎癥，導(dǎo)致與陰性對(duì)照組相比，其他兩組炎性反應(yīng)膜的厚度和細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量的明顯增加。陰性對(duì)照組的炎性反應(yīng)膜的平均厚度為125.8±5.58μm，而陽(yáng)性對(duì)照組的炎性反應(yīng)膜

14、的平均厚度為449.81±10.59μm(p＜0.001)。同時(shí)細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量從4749±144個(gè)細(xì)胞/平方毫米（陰性對(duì)照組）增加到6564±144個(gè)細(xì)胞/平方毫米（陽(yáng)性對(duì)照組）(p＜0.001)。盡管在所有UHMWPE顆粒處理組中巨噬細(xì)胞的比例與陰性對(duì)照組相比明顯增加，但是，IL-10處理組的細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量明顯減少（5674±139個(gè)細(xì)胞/平方毫米，p＜0.001）。
　　2.IL-10在M2型巨噬細(xì)胞極化和骨溶解中的作

15、用
　　包裹有股骨的炎性反應(yīng)膜的組織學(xué)評(píng)估表明與陰性對(duì)照組相比其他兩組炎性反應(yīng)膜中iNOS陽(yáng)性巨噬細(xì)胞和CD163陽(yáng)性巨噬細(xì)胞明顯增多(p＜0.01)。然而與只有UHMWPE顆粒處理的陽(yáng)性對(duì)照組相比IL-10處理組減弱了iNOS蛋白的表達(dá)(p＜0.05)，另一方面IL-10處理組明顯增強(qiáng)了CD163蛋白的表達(dá)(p＜0.05)。
　　TRAP染色表明IL-10處理組的切片中TRAP陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量明顯減少，而只有UHMWPE顆粒

16、處理的切片表現(xiàn)為很強(qiáng)的TRAP活性(p＜0.001)。Micro CT掃描顯示IL-10能夠明顯的減輕UHMWPE顆粒誘導(dǎo)的骨溶解，骨密度(BMD)分析表明IL-10處理組的骨密度明顯高于只有UHMWPE處理的陽(yáng)性對(duì)照組(p＜0.001)，同時(shí)，骨體積與總體積的比值分析表明IL-10處理組的骨體積比例更高(p＜0.001)。
　　3.實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)STAT1、NF-κBp65、JNK1、STAT3、SHIP、STAT6和

17、PPAR-γ的基因表達(dá)
　　數(shù)據(jù)顯示經(jīng)過(guò)IL-10處理后不僅抑制了STAT1(p＜0.05)、NF-κBp65(p＜0.05)和JNK1(p＜0.01)的基因表達(dá)，而且誘導(dǎo)了STAT3(p＜0.05)的基因表達(dá)。然而，STAT6、SHIP和PPAR-γ的基因表達(dá)沒(méi)有明顯的差異。
　　4.Western blot檢測(cè)信號(hào)通路蛋白
　　IL-10處理組的樣品與只有UHMWPE顆粒處理組樣品相比表現(xiàn)為低表達(dá)磷酸化的STAT1