轉(zhuǎn)錄因子ZmNAM056調(diào)控玉米淀粉合成相關(guān)基因表達(dá)的初探.pdf

1、玉米（Zea mayL.）是世界第一大糧食作物，種植面積和產(chǎn)量均居三大糧食作物之首，玉米淀粉也是各種植物淀粉中化學(xué)成分最佳的淀粉之一。如今，隨著世界人口的日益增加，資源及耕地面積的日益減少，對(duì)作物產(chǎn)量及品質(zhì)的要求也就越來越高。
　　淀粉的生物合成過程的核心包括ADPG的合成，多糖鏈的延伸，多糖鏈的的分支，多糖鏈的去分支。淀粉的生物合成是一個(gè)十分復(fù)雜的過程，是在一系列酶的共同催化下完成的，在籽粒胚乳中淀粉合成的最后階段涉及四類非常關(guān)

2、鍵的酶類:腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-glucose pyrophosphorylase，AGPase)、淀粉合成酶(Starch synthase，SS)、淀粉分支酶(Starch branching enzyme，SBE)和淀粉去分支酶(Starch debranching enzyme，DBE)。目前對(duì)于淀粉相關(guān)合成酶的功能研究做得相對(duì)成熟，但對(duì)于淀粉合成相關(guān)酶的上游調(diào)控機(jī)制研究，即淀粉合成相關(guān)酶的順式作用元件和反式作用因

3、子的研究報(bào)道較少。
　　我們根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道和現(xiàn)有基因資源選取在玉米胚乳中特異表達(dá)或高表達(dá)的參與淀粉合成關(guān)鍵酶編碼的8個(gè)基因:Sh2、Bt2、SSⅠ、SSⅡa、SSⅢa、sbe1、sbeⅡb、Isa1。課題組前期通過RNA-seq測(cè)定玉米籽粒灌漿時(shí)期不同關(guān)鍵點(diǎn)胚乳RNA表達(dá)譜，篩選了可能參與玉米胚乳淀粉合成的轉(zhuǎn)錄因子;同時(shí)利用公共數(shù)據(jù)庫(kù)通過共相關(guān)分析、篩選與上述8個(gè)淀粉合成相關(guān)基因表達(dá)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，取相關(guān)系數(shù)極高的轉(zhuǎn)錄因子列為候選轉(zhuǎn)

4、錄因子。我們比較通過這兩種方法篩選到的候選轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)共同的NAC家族的轉(zhuǎn)錄因子，并命名為ZmNAM056。在此基礎(chǔ)之上采用半定量RT-PCR或熒光定量PCR、基因瞬時(shí)表達(dá)、酵母單雜交以及亞細(xì)胞定位繼續(xù)驗(yàn)證篩選的轉(zhuǎn)錄因子對(duì)淀粉合成關(guān)鍵酶基因表達(dá)的調(diào)控作用，具體結(jié)果如下:
　　1、以玉米優(yōu)良骨干自交系B73為實(shí)驗(yàn)材料，我們成功從玉米胚乳中克隆到該轉(zhuǎn)錄因子，該基因含有一個(gè)編碼391個(gè)氨基酸的開放閱讀框。其他植物氨基酸序列進(jìn)行同

5、源比對(duì)，發(fā)現(xiàn)ZmNAM056轉(zhuǎn)錄因子含有NAC轉(zhuǎn)錄因子特有的N端DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和C端轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域。
　　2、對(duì)ZmNAM056基因表達(dá)模式進(jìn)行了分析。半定量PCR結(jié)果表明ZmNAM056基因在籽粒中特異表達(dá);隨后實(shí)時(shí)熒光定量PCR，結(jié)果表明ZmNAM056基因在授粉后前7天的籽粒中表達(dá)量較低，授粉后10天開始大量表達(dá)，授粉后20天達(dá)到最高，并且發(fā)現(xiàn)同玉米胚乳淀粉合成相關(guān)基因表現(xiàn)出極強(qiáng)的正相關(guān)。同時(shí)還研究了不同糖類和植物激素對(duì)胚

6、乳淀粉合成相關(guān)基因及ZmNAM056基因表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中AGPase基因Brittle-2、Shrunken-2在所處理?xiàng)l件下其表達(dá)趨勢(shì)是一致的，都受Glu、Suc、ABA的誘導(dǎo)，F(xiàn)ru、Tre的抑制;淀粉合成酶類(SSs)基因，SSⅡa受Glu的顯著誘導(dǎo)，卻不受ABA的誘導(dǎo)，SSⅢa受ABA的顯著誘導(dǎo)，卻不受Glu的誘導(dǎo)，SSⅠ受Glu跟ABA的顯著誘導(dǎo);淀粉合成分支酶類(SBE)基因BEI受Tre、Suc的顯著誘導(dǎo)，而SBE

7、Ⅱb受Fru、Glu的顯著誘導(dǎo)。這些結(jié)果說明同一個(gè)基因在不同處理?xiàng)l件下，其表達(dá)是有很大差異的，不同基因在相同條件處理時(shí)，有些基因的表達(dá)趨勢(shì)是一致的，而有些表達(dá)趨勢(shì)又是有差異的。其中蔗糖、葡萄糖、ABA對(duì)這些基因的表達(dá)影響較大。ZmNA M056基因的表達(dá)卻不受蔗糖的影響;激素ABA跟葡萄糖促進(jìn)ZmNAM056基因的表達(dá)，有趣的是蔗糖跟ABA協(xié)同處理時(shí)，促進(jìn)效果更明顯。
　　3、構(gòu)建35S∷ZmNAM-GFP融合蛋白表達(dá)載體，通過基

8、因槍轟擊介導(dǎo)洋蔥表皮細(xì)胞進(jìn)行亞細(xì)胞定位，結(jié)果表明Zm NA M056編碼蛋白定位于細(xì)胞核中;通過酵母轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)分析表明，ZmNAM056基因編碼蛋白具有轉(zhuǎn)錄激活性。同時(shí)克隆玉米ZmNAM056蛋白的編碼序列連接入pET-28載體，在大腸桿菌RosettaTM(DE3)菌株中進(jìn)行原核表達(dá)，然后通過Ni-Agarose柱純化6×His-ZmNAM056融合蛋白。
　　4、通過基因槍轟擊介導(dǎo)玉米胚乳的瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)以及酵母單雜交實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄