Jagged1-Notch通路在肺癌骨轉移中對破骨前體細胞的作用.pdf

1、背景和目的:
　　腫瘤轉移是腫瘤患者死亡的首要原因,而骨是腫瘤轉移的好發(fā)部位之一。約30~40％晚期肺癌患者出現(xiàn)骨轉移,肺癌骨轉移多為溶骨性損害,導致嚴重骨痛、病理性骨折、高鈣血癥及脊髓壓迫等一系列并發(fā)癥,嚴重影響患者的生活質量和生存時間。因此,積極防治肺癌骨轉移具有重要的意義。腫瘤細胞轉移到骨髓后分泌多種因子,并與骨微環(huán)境中的造血干細胞、破骨細胞(osteoclasts, OCs)、成骨細胞(osteoblasts, OBs)等

2、宿主細胞及骨髓基質發(fā)生相互作用,形成“惡性循環(huán)”。阻斷此過程可望有效干預腫瘤骨轉移進程,但目前肺癌骨轉移的相關分子機制仍不明確。
　　Jagged1是 Notch通路配體之一,其與相鄰細胞的 Notch特異性受體結合后激活Notch通路,進而發(fā)揮生物學作用。Notch通路可被γ-分泌酶抑制劑3,5-二氟笨乙酰-L-丙氨酰-S-苯基甘氨酸 t-丁酯{N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]- S

3、-phenylglycine t-butyl ester,DAPT}阻斷。Notch信號通路在胚胎發(fā)育中起到重要作用,對成體細胞分化、增殖等生理功能具有重要的調控作用,其異常活化與很多疾病的發(fā)生、發(fā)展相關。近期的研究表明,Jagged1/Notch信號通路在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉移過程中均具有重要作用。高表達Jagged1的前列腺癌和乳腺癌患者預后不佳,同樣Notch高表達的非小細胞肺癌患者預后也不佳。Notch通路在生理狀態(tài)對破骨前體細

4、胞的分化成熟及功能具有重要的調控作用,但 Jagged1/Notch通路在肺癌骨轉移等病理條件下對破骨前體細胞的影響還未見相關報道。
　　本課題通過免疫組織化學染色檢測 Jagged1在肺癌骨轉移患者轉移灶及癌旁組織標本的表達情況,以明確Jagged1與肺癌骨轉移的關系。并通過體外實驗,研究Jagged1對 CD14+單核細胞增殖及其向破骨細胞分化的影響,進而研究 Notch通路在肺腺癌A549細胞條件培養(yǎng)液(Conditione

5、d medium, CM)調控CD14+單核細胞增殖及向破骨細胞分化中的作用,闡明肺癌溶骨性骨轉移的可能機制,為肺癌骨轉移患者“骨相關事件”的治療提供新的靶點。
　　方法:
　　首先檢測肺癌骨轉移患者轉移灶及癌旁組織標本 Jagged1表達,檢測 Jagged1對CD14+單核細胞向破骨細胞分化、增殖的影響,并檢測Notch通路所起的作用。然后,收集A549 CM,檢測其對CD14+單核細胞向破骨細胞分化、增殖的影響及Not

6、ch通路所起的作用。
　　一、Jagged1對CD14+單核細胞破骨分化、增殖的影響
　　免疫組織化學法檢測 Jagged1在肺癌骨轉移患者轉移灶和癌旁組織標本中的表達;Ficoll法聯(lián)合磁珠分選法分離純化人外周血CD14+單核細胞,CD14+單核細胞分為Control group、Jagged1 group、DAPT group,用含(人)巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating f

7、actor, M-CSF)的α-MEM細胞培養(yǎng)液培養(yǎng),Jagged1 group加入Jagged1重組蛋白,DAPT group加入Jagged1重組蛋白及DAPT。實時熒光定量聚合酶鏈反應(Real-time quantitative polymerase chain reaction, qPCR)檢測破骨細胞標志基因抗酒石酸性磷酸酶(Tartrate-resistant acid phosphatase, TRAP)、組織蛋白酶 K

8、(Cathepsin K, CK)、降鈣素受體(Calcitonin receptor, CTR)及 Notch靶基因Hes-1(hairy and enhancer of split-1)、Hey-1(HES-related with YRPW motif-1) mRNA的表達;TRAP染色鑒定所分化破骨細胞;掃描電子顯微鏡(scanning electron microscopy, SEM)檢測破骨細胞溶骨功能。CCK-8(Cell

9、 Counting Kit-8)法檢測各組CD14+單核細胞的增殖。
　　二、Notch通路在A549細胞條件培養(yǎng)液調控CD14+單核細胞破骨分化、增殖過程中的作用
　　CD14+單核細胞分為Control group、A549 CM group、DAPT group,用含M-CSF的α-MEM細胞培養(yǎng)液培養(yǎng),A549 CM group加入10%A549 CM,DAPT group加入10%A549 CM及DAPT。qPCR

10、檢測TRAP、CK、CTR及Notch靶基因Hes-1、Hey-1mRNA的表達;TRAP染色鑒定破骨細胞;SEM檢測破骨細胞溶骨功能;CCK-8法檢測CD14+單核細胞增殖。細胞免疫熒光法檢測Notch活性片段NICD的表達。
　　實驗結果:
　　第一部分 Jagged1促進 CD14+單核細胞破骨分化成熟,并抑制其增殖
　　一、Jagged1在肺癌骨轉移灶標本中高表達,在癌旁組織低表達或無表達;
　　二、Ja

11、gged1促進CD14+單核細胞TRAP、CK、CTR mRNA的表達;
　　三、Jagged1促進CD14+單核細胞形成TRAP+多核細胞;
　　四、Jagged1增加CD14+單核細胞破骨分化及骨溶解;
　　五、Jagged1抑制CD14+單核細胞的增殖;
　　六、Jagged1增加CD14+單核細胞Notch靶基因Hes-1、Hey-1 mRNA的表達。
　　第二部分 A549 CM通過活化Notch

12、通路促進CD14+單核細胞向破骨細胞分化,而DAPT可促進其促CD14+單核細胞增殖作用。
　　一、A549 CM活化Notch通路促進CD14+單核細胞TRAP、CK、CTR mRNA的表達;
　　二、A549 CM活化Notch通路促進CD14+單核細胞形成TRAP+多核細胞;
　　三、A549 CM活化Notch通路促進CD14+單核細胞破骨分化及骨溶解;
　　四、DAPT可增加A549 CM促進CD14+

13、單核細胞增殖的能力;
　　五、A549 CM增加CD14+單核細胞Notch靶基因Hes-1、Hey-1 mRNA的表達;
　　六、A549 CM促進CD14+單核細胞NICD向細胞核內轉移。
　　結論:
　　Jagged1在肺癌骨轉移患者標本中高表達,在癌旁組織低表達或無表達。Jagged1/Notch通路促進 CD14+單核細胞向破骨細胞分化且抑制其增殖。肺腺癌 A549細胞可通過活化 Notch通路促進 C