高親和力ABLSH3片段競爭性結合RIN1抑制BCR-ABL活性和增加伊馬替尼敏感性的研究.pdf

1、Bcr-Abl融合蛋白具有異常激活的酪氨酸激酶活性，是慢性粒細胞白血病（Chronic myelogenous leukemia，CML）的典型標志，位于Abl段的SH3結構與Bcr-Abl蛋白激酶活性激活有著直接的關系，可負向調控Bcr-Abl的活性，其關鍵位點的突變或結合配體的改變均可引起伊馬替尼（Imatinib，IM）耐藥。有研究發(fā)現(xiàn)耐 IM慢粒細胞株 KCL22高表達RIN1蛋白，而對IM敏感的細胞株中RIN1表達較低。RIN

2、1是作為Abl的一個直接的激活因子控制對IM敏感的調定點。RIN1是Ras抑制因子1，含Abl結合結構域（Abl binding domain，ABD）。RIN1富含脯氨酸的序列（PPAVPPPPVP）通過與Abl的SH3（PxxP motif）低親和力的結合引起 RIN1 Tyr36的磷酸化，隨后和 SH2作用，導致Abl構象的改變，自抑制結構被解除，激活Bcr-Abl，繼而促進Abl底物的磷酸化，而對Bcr-Abl蛋白的表達無影響，

3、并且這種作用不依賴于SRC介導的Abl酪氨酸激酶結構域（TKD）磷酸化活性，亦不受Bcr-Abl T315I突變的影響。因此，RIN1已經(jīng)成為IM耐藥的研究熱點之一。
　　本課題嘗試采用直接阻滯Bcr-Abl與RIN1兩者之間作用的策略，通過計算機模擬技術，篩選Abl SH3與RIN1 ABD結合的最佳片段，并在保持其高度特異性的前提下，將Abl SH3結構突變，使RIN1與Bcr-Abl SH3結構的低親和力結合方式轉變?yōu)楦哂H和

4、力。通過構建突變體重組腺病毒載體，分別選取高表達和低表達 RIN1的細胞株 KCL22（耐IM細胞株）和K562及IM耐藥的K562/G01為模型，研究其在細胞內是否通過競爭性結合的方式與RIN1相結合從而調控Bcr-Abl酪氨酸激酶活性，同時聯(lián)合 IM用藥，在體外細胞實驗探討高親和力的Abl SH3對CML細胞株的影響及相關的作用機制。旨在為CML聯(lián)合用藥和耐藥治療奠定基礎。
　　采用的主要實驗方法如下：
　　1.利用分子

5、動態(tài)模擬和計算機分子模擬軟件找出Abl SH3片段與RIN1富含脯氨酸區(qū)域結合的關鍵氨基酸，結合文獻報道，突變單/兩個氨基酸位點或改變序列長度，NAMD2.8軟件Amber力場下動力學模擬突變后的結構，PepSite2.0軟件預測SH3突變體與RIN1富含脯氨酸膜體的結合，根據(jù)P值大小判斷親和力。VMD1.8.7和PyMCL可視化圖形軟件分析不同的SH3突變體結構，計算RMSd分析結構的穩(wěn)定性。設置對照：反義突變（結合力下降）和野生型（

6、未突變）。
　　2.構建重組腺病毒載體表達 SH3-m突變體（SH3-mutant）和野生型，通過實驗驗證突變體的作用，繼而篩選有效應的高親和力突變體。免疫熒光法檢測突變體和野生型在 CML細胞中的定位；Western blot測定突變體的有效性。免疫共沉淀和質譜技術分析SH3-m與RIN1的相互作用。選擇作用效果明顯的突變體進行后續(xù)的實驗。
　　3.體外細胞實驗分析上述篩選出的SH3-m突變體聯(lián)合IM用藥，對KCL22和

7、K562細胞的效應及 Bcr-Abl活性的影響和作用機制。MTT和流式細胞術檢測細胞周期分析細胞增殖情況；光鏡檢測細胞結構變化、流式細胞術分析突變體對細胞凋亡的影響；Western blot分析Bcr-Abl活性、底物磷酸化水平的變化以及 Bcr-Abl下游 PI3k/Akt、Ras/Raf/Mek/Erk1/2信號通路各指標的變化；免疫熒光技術觀察細胞骨架的重建情況。
　　獲得的實驗結果和結論如下：
　　1.用計算機分子模

8、擬技術（PepSite2.0軟件）分析出RIN1富含脯氨酸的結構域與 Abl SH3結構域結合的關鍵氨基酸是位于 Abl SH3 domain上疏水口袋周圍的含有苯環(huán)或類苯環(huán)的芳香族氨基酸（脯氨酸：Pro、色氨酸：Trp、天冬氨酰：Asn、酪氨酸：Tyr、苯丙氨酸：Phe），將這些氨基酸進行一系列突變，P-value預算結合特異性，選擇結合能力高的三個突變體T79Y，N94W和T79YN94W（雙突變）和結合能力低的突變體：W99R及野

9、生型結構，NAMD和VMD軟件成功演算穩(wěn)定的結構。其中，低結合能力W99R及野生型為對照。
　　2.成功構建六個重組腺病毒載體（包括不含目的片段的載體）：pAd-SH3、pAd-W99R、pAd-N94W、pAd-T79Y、pAd-T79YN94W和pAd-null（以下分別簡稱為：M0、M1、M2、M3、M4、T）。各種突變體能高效感染靶細胞并有不同的亞細胞定位：M0、M1、M3和T位于胞漿，M2和M4定位于胞漿和胞核。West

10、ern blot結果表明：與M0和T相比較，M1和M3抑制Bcr-Abl磷酸化蛋白的表達，抑制下游Stat5和Crkl磷酸化水平，而M2和M4作用與此相反。免疫共沉淀和質譜檢測均證實M3、M4能與RIN1結合，M1不能與RIN1結合。因此，后續(xù)實驗重點研究高親和力M3的效應及機制。
　　3.體外細胞實驗證明，高親和力 M3突變體聯(lián)合 IM能顯著抑制KCL22和K562細胞生長，使細胞周期阻滯在S期，在IM中等耐藥細胞株KCL22中

11、效果優(yōu)于IM敏感株K562。形態(tài)學觀察到兩株細胞均出現(xiàn)核碎裂、空泡和核聚集的現(xiàn)象，流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)細胞凋亡；Western blot顯示能明顯抑制Bcr-Abl、Stat5和Crkl磷酸化水平，以及下調凋亡相關蛋白 Bcl-2、c-Myc和周期蛋白 CyclinD1的表達，上調Bax的表達。免疫熒光觀察到細胞骨架微絲或者微管蛋白出現(xiàn)明顯的聚集，且有邊緣化或者向中間聚集的現(xiàn)象。實驗中意外發(fā)現(xiàn)：M1突變體雖未與RIN1結合，但聯(lián)合IM也能

12、顯著抑制KCL22和K562細胞增殖，促進細胞凋亡。
　　綜上所述，本課題將計算機模擬技術篩選出的高親和力 Abl SH3突變體M3聯(lián)合IM用藥，體外實驗顯示能有效地抑制CML細胞增殖、促進細胞凋亡，其機制是阻滯了Bcr-Abl與RIN1的結合，從而抑制了Bcr-Abl活性及底物和磷酸化。本文的意義在于，通過對Abl SH3結構及其與Bcr-Abl活性關系的深入研究，為CML治療方面特別是IM耐藥患者提供了分子靶點，同時也為臨床聯(lián)