艱難梭菌細胞毒素B羧基末端功能區(qū)的克隆、表達及其生物學特性研究.pdf

1、目的：艱難梭菌(Clostridiumdifficiie)是造成抗生素相關性結腸炎及偽膜性結腸炎(PMC)的最常見致病菌。該菌造成老年人和免疫功能低下的病人抗生素相關性腹瀉及腸炎的發(fā)病率及死亡率明顯升高。Cdifficile產毒株準確快速的診斷、鑒定，對確定病源、控制其傳播、有效治療患者是極其重要的。國外建立的酶聯免疫吸附實驗(ELISA)檢測Cdifficile毒素，其優(yōu)點是靈敏度和特異度高，結果可在2-4小時內得出，從而更適合指導臨

2、床實際工作，故被大力推廣，但國內對艱難梭菌診斷試劑研究較少，尤其是對Cdifficile細胞毒素B(cdtB)的檢測。本課題利用cdtB特點，以基因工程技術對其羧基末端功能區(qū)進行克隆、表達并純化出該蛋白，制備多克隆抗體，主要目的在于對該重組蛋白生物學特性進行研究和探索，以期建立一種可快速、穩(wěn)定的檢測出Cdifficile細胞毒素B的ELISA診斷試劑。 方法：1、基因工程技術制備cdtB膜受體結合區(qū)域的重組蛋白。以Cdiffic

3、ile標準株VPI10463的全長DNA序列為模板，利用PCR技術擴增出編碼cdtB膜受體結合區(qū)域的功能基因，經EcoRI和XhoI雙酶切后，定向插入同樣經這兩種酶雙酶切的原核表達載體pET-22b(+)中，在DNAT4連接酶作用下進行連接以獲得重組質粒。重組質粒經測序，結果與GenBank記錄的CdifficileVPI10463的cdtB羧基末端(bp5649-7496)基因序列相比對。將正確的重組子轉化至E.coliBL21(DE

4、3)細菌中，經IPTG誘導表達出特異性蛋白，利用SDS-PAGE檢測重組蛋白。 2、親和色譜法純化重組蛋白并進行WESTERN-BLOT分析。因表達載體pET-22b(+)具有His.Tag序列，故與固定化金屬離子(Ni2+)之間具有親合力，金屬螯合到固相支持物共價結合的反應性基團亞氨二乙酸(IDA)上，用咪唑將重組蛋白洗脫下來，從而達到純化的目的。本研究選用NOVagen公司的His.Tag親合純化產品-His.Bind樹脂和

5、緩沖液試劑盒。純化后采用CoomassiebrilliantblueG-250比色法，以牛血清白蛋白(BSA，Sigma)為標準建立標準曲線，測定重組蛋白濃度；并利用His.tag單克隆抗體與重組蛋白進行WESTERN-BLOT分析。 3、多克隆抗體制備及其生物學特性的研究。以純化重組蛋白為抗原，免疫純種雄性新西蘭大白兔，在第4次加強免疫后第10天，制備多抗血清，利用雙向免疫擴散法和間接酶聯免疫吸附實驗(ELISA)法檢測抗體效

6、價，同時檢測重組蛋白和從NOVagen公司購得的Cdifficile細胞毒素B這兩種材料的抗原相關性。以重組蛋白與制備的多抗血清進行WESTERN-BLOT分析以檢測抗體的特異性。用自制的多克隆抗體通過間接ELISA法對5株艱難梭菌產毒株、2株大腸桿菌、1株雙歧桿菌進行艱難梭菌B毒素檢測。 結果：1、利用PCR技術擴增出編碼cdtB膜受體結合區(qū)域的功能基因為1848bp，經測序與相應Cdifficile標準株VPI10463序列

7、區(qū)域的基因完全相同。目的基因與原核表達載體pET-22b(+)連接后獲得的重組質粒，測序結果與GenBank記錄的CdifficileVPI10463的cdtB羧基末端(bp5649-7496)基因序列相比對符合率達99％。將經鑒定的cdtBR陽性克隆子在IPTG的誘導下表達，然后進行10％SDS-PAGE電泳分析，結果發(fā)現，經誘導后表達的重組蛋白相對分子質量為71300，與預期的蛋白大小一致。 2、根據金屬螯合親和色譜法在非變

8、性條件下純化重組蛋白，純化后的可溶性重組蛋白相對分子質量為71300，有少許降解，純度達到90％。重組蛋白純化后根據CoomassiebrilliantblueG-250chromatometry比色法測出的蛋白濃度為0.762mg/ml。免疫印跡試驗說明重組蛋白與HisTag單克隆抗體可以發(fā)生特異性結合 3、獲得了相應的多克隆抗血清，重組蛋白的抗原性是Cdifficile細胞毒素B抗原性的一部分。WESTERN-BLOT分析：

9、抗艱難梭菌B毒素膜受體結合蛋白多克隆抗體可以和重組蛋白cdtBR結合，與E.coli菌體裂解蛋白有非特異性的反應。間接酶聯免疫吸附實驗(ELISA)法測定抗體效價均為1：10000以上。自制多克隆抗體對8株臨床細菌進行艱難梭菌B毒素檢測顯示，3株艱難梭菌產毒株、1株大腸桿菌為陽性結果，其余為陰性結果。 結論l、本研究參考Cdifficile國際標準株VPI10463基因序列，用自行設計的CDB3引物在PCR反應中表現出較高的特異

10、性，為理想的引物序列。蛋白電泳分析表明獲得了高效表達的CdifficileToxinB3克隆株。 2、本研究利用基因工程得到的重組蛋白，western-blot證實表達的蛋白與本研究所設計相一致。為進一步研究CDAD的診斷試劑和免疫保護作用奠定了重要的實驗基礎。 3、通過動物實驗本研究發(fā)現，重組蛋白具有良好的免疫原性，該多克隆抗體具有良好的生物學活性、較好的特異性。但因為是多克隆抗體，故特異性不高，需要更深入地研究此重組