艱難梭菌毒素A和B適配體的篩選與鑒定.pdf

1、目的:
　　通過(guò)構(gòu)建80 bp的單鏈DNA(Single strand DNA，ssDNA)隨機(jī)文庫(kù)，采用指數(shù)富集配體進(jìn)化（ Systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX）技術(shù)篩選與艱難梭菌毒素 A和 B結(jié)合率和親和力強(qiáng)的適配體，為建立快速、準(zhǔn)確診斷艱難梭菌感染(Clostridium difficile infection, CDI)提供新的實(shí)驗(yàn)室

2、診斷方法。
　　方法:
　　一、pET-28b-tcdA-C與 pET-28b-tcdB-N原核表達(dá)載體的構(gòu)建及重組蛋白毒素A和B的表達(dá)和純化
　　（1）分別設(shè)計(jì)特異性引物，用 PCR技術(shù)分別擴(kuò)增出毒素 A羧基末端（C7158-8130）和毒素B氨基末端(N1-1629)基因片段。
　　（2）PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和pMDTM19-T分別進(jìn)行DNA內(nèi)切酶酶切反應(yīng)，回收酶切毒素A羧基末端和毒素B氨基末端基因片段與pMDTM

3、19-T載體相連，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌（Escherichiacoli,E coli）DH5α中，涂布于氨芐青霉素抗性平板篩選出陽(yáng)性克隆菌落。
　?。?）經(jīng)測(cè)序正確后分別提取并雙酶切 pMDTM19-T-tcdA-C與pMDTM19-T-tcdB-N重組質(zhì)粒，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳回收tcdA-C和tcdB-N基因片段，構(gòu)建 pET-28b-tcdA-C與 pET-28b-tcdB-N原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化到 E.coli BL21(DE3)。

4、
　?。?）E.coli BL21(DE3)培養(yǎng)至OD600約為0.6時(shí)，調(diào)整IPTG終濃度分別為0.3、0.6、0.8、1.0、1.5mmol/L，誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間分別為2、4、6、8、10h，誘導(dǎo)表達(dá)溫度分別為25、30、37℃，選擇最適的表達(dá)條件，采用Ni-NTA親和層析柱純化目的重組蛋白，利用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定純化蛋白的濃度并對(duì)重組蛋白毒素A和B進(jìn)行Western-blot鑒定。
　　二、隨機(jī)文庫(kù)的構(gòu)建以及重組蛋白

5、毒素A和B適配體的篩選
　?。?）設(shè)計(jì)合成全長(zhǎng)為80bp的ssDNA隨機(jī)文庫(kù)，兩端為20個(gè)堿基的固定序列，以便設(shè)計(jì)相應(yīng)引物用于文庫(kù)擴(kuò)增，中間40個(gè)堿基為隨機(jī)序列，構(gòu)建ssDNA的文庫(kù)容量達(dá)到440。
　?。?）分別以重組蛋白毒素 A和 B為靶分子，將蛋白分別包被于96孔板上，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照孔，經(jīng)反篩后將未與空白對(duì)照孔結(jié)合的ssDNA分別放入包被有重組蛋白毒素A和B的板孔中孵育，洗滌棄去未與靶蛋白結(jié)合的ssDNA，然后洗脫與

6、靶蛋白結(jié)合的ssDNA，用上游引物和5’端標(biāo)記有生物素的下游引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，將ssDNA擴(kuò)增為dsDNA，此時(shí)非文庫(kù)鏈的5’端即可標(biāo)記上生物素；
　　（3）將上述步驟所得的PCR產(chǎn)物和鏈霉親和素磁珠混合，PCR產(chǎn)物通過(guò)生物素與磁珠上的親和素結(jié)合，加入適量的堿性溶液，使dsDNA解鏈成ssDNA，5’端標(biāo)記有生物素的非文庫(kù)鏈仍然與磁珠相連，而文庫(kù)鏈游離在溶液中，利用磁力架吸引磁珠分離并獲得次級(jí)ssDNA候選庫(kù)。
　?。?）

7、將次級(jí)ssDNA候選文庫(kù)再分別與毒素A和B溫育，進(jìn)入第二輪篩選。如此循環(huán)，隨著篩選輪數(shù)的不斷增加，親和力低的ssDNA逐漸被淘汰。經(jīng)過(guò)大約6-13輪篩選后，分別與重組毒素A和B結(jié)合力強(qiáng)的適配體得到富集。各輪篩選完畢，每一輪篩選后收集的ssDNA文庫(kù)量與相應(yīng)輪數(shù)反篩后的ssDNA文庫(kù)量的比值，即得到每輪結(jié)合反應(yīng)的結(jié)合率，結(jié)合率達(dá)到穩(wěn)定后，停止篩選。
　?。?）利用正常上下游引物擴(kuò)增結(jié)合率穩(wěn)定的篩選文庫(kù)，純化 PCR產(chǎn)物并進(jìn)行克隆測(cè)序

8、，分析測(cè)序所得ssDNA序列和二級(jí)結(jié)構(gòu)，分別找到與重組蛋白毒素A和B結(jié)合較理想的ssDNA作為毒素A和B的適配體。
　　（6）根據(jù)非競(jìng)爭(zhēng)性 ELISA法檢測(cè)篩選富集的適配體與重組蛋白的親和常數(shù)。
　　結(jié)果:
　?。?）分別成功擴(kuò)增出艱難梭菌毒素 A羧基末端和毒素 B氨基末端976bp和1629 bp基因序列，將其與pMDTM19-T載體相連，測(cè)序無(wú)基因突變。
　?。?）雙酶切重組質(zhì)粒后分別回收 tcdA-C和 t

9、cdB-N基因片段，成功構(gòu)建了pET-28b-tcdA-C、pET-28b-tcdB-N原核表達(dá)載體。
　　（3）經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE電泳分析可知，在誘導(dǎo)菌液上清液中分別出現(xiàn)蛋白分子量約為35KDa、60KDa的目的蛋白，與預(yù)期值相符。
　　（4）經(jīng)Ni-NTA親和柱純化后，SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，重組蛋白毒素A和B得到了較好的純化，測(cè)定重組蛋白毒素A和B的濃度分別為138μg/ml與55ug/ml，W

10、estern blot檢測(cè)證明重組毒素A和B能夠很好的與艱難梭菌毒素A和B相對(duì)應(yīng)的單克隆抗體結(jié)合。
　?。?）以重組蛋白毒素A和B為靶標(biāo)，采用SELEX技術(shù)進(jìn)行適配體的篩選，隨著篩選輪數(shù)的不斷增加，隨機(jī)ssDNA文庫(kù)分別與重組蛋白毒素A和B的結(jié)合率分別從1.4％增加到44.6%和從0.8%增加到39.6%，且在第10、11、12輪的結(jié)合率增加幅度均不明顯，表示結(jié)合率趨于穩(wěn)定，停止篩選。
　?。?）選擇第12輪篩選后的文庫(kù)進(jìn)行

11、克隆測(cè)序，經(jīng)一級(jí)結(jié)構(gòu)和二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析，重組蛋白毒素A篩選的適配體出現(xiàn)了6組完全相同的序列，重組蛋白毒素B篩選的適配體出現(xiàn)了4組完全相同的序列，分別選擇Apt-A22和Apt-B20兩條適配體進(jìn)行后續(xù)的親和常數(shù)的檢測(cè)。
　　（7）利用非競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定重組蛋白毒素A與適配體Apt-A22的親和常數(shù)值為22.47×106 M-1；重組蛋白毒素 B與適配體 Apt-B20的親和常數(shù)值為37.64×106 M-1。
　　結(jié)論:<